Geri Dön

Nöral hücre hattında reelin glikoproteininin glikan profilinin belirlenmesi

Determining the glycan profile of reelin glycoprotein in neural cell line

PDF İndir

  1. Tez No: 527883
  2. Yazar: RAMİZ DEMİR
  3. Danışmanlar: PROF. DR. REMZİYE DEVECİ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2018
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ege Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 78

Özet

Reelin, nöral gelişmede çok önem taşıyan iyi korunmuş bir ekstraselüler glikoproteindir. Reelin proteinindeki bozukluklar ve RELN geninde meydana gelen mutasyonlar sonucu oluşan nöral hastalıklara ilişkin birçok çalışma yapılmıştır. Ancak, bu hastalıklarda Reelin'in yapısında bulunan glikanların olası rolü hakkında herhangi bir bilgi bulunmadığı gibi, Reelin'in yapısında yer alan glikanlar hakkındaki bilgiler de çok sınırlıdır. Glikoproteinlerin yapısında yer alan farklı glikan birimleri proteinlerin mikroçevresini değiştirerek görevlerini kontrol edebilirler. Böylece, hücrenin neredeyse tüm işlevlerinde doğrudan veya dolaylı olarak görev alırlar. Aynı aminoasit sıralarına sahip iki proteindeki glikozilasyon değişiklikleri proteinin işlevini doğrudan değiştirebildiği için, Reelin glikoproteininin glikan zincirlerinin de molekülün işlevi üzerinde etkili olması yüksek bir olasılıktır. Bu nedenle bu tez çalışmasında; SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattından Reelin glikoproteinini ve önemli fragmanlarını izole etmek ve bu izolatların uç glikan profillerini lektin blotlama ile, bu glikanların yapı (monosakkarit) analizlerini ise CapLC-ESI-MS/MS ile belirlemek amaçlanmıştır. Bu amaçla, SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattı kullanılmıştır. Hücreler uygun koşullar altında kültüre edikten sonra total ve sitoplazmik protein ekstraksiyonları yapılmıştır. Western Blotlama ile hangi bandın/bantların Reelin proteinine ait olduğu belirlenmiştir. Bu bantların taşıdığı uç glikan birimlerini saptamak için SNA, MAA, GNA, PNA ve DSA lektinleri kullanılarak lektin blotlama yapılmıştır. Hücre hattından immün çöktürme tekniği ile, Reelin glikoproteini izole edilmiştir. İzole edilen Reelin fragmanının monosakkarit analizi, CapLC-ESI-MS/MS sistemi ile gerçekleştirilmiştir. SH-SY5Y nöroblastoma hücre hattının total protein profili SDS-PAGE ile üç farklı lizis tampon (Ripa, NucBuster, IP-lysis) kullanılarak gösterilmiş, her üçünde de çok yakın sonuçlar elde edilmiştir. Reelin, 400, 310, 250 ve 85 kDa ağırlıklarında olmak üzere dört fragman şeklinde elde edilmiştir. Reelin glikoprotein fragmanlarında uç glikan olarak, α2,6 ve α2,3 bağlı sialik asitler, β-Galaktoz, α-Mannoz, β-GlcNAc saptanmıştır. Bant alan yoğunluğu bakımından en yüksek değer 400 kDa Reelin fragmanındaki α2,3 bağlı sialik asit bandında, 601 birim olarak bulunmuştur. Dört Reelin fragmanındaki toplam bant alan değerleri fazladan aza doğru sırasıyla α2,3 bağlı sialik asit (1224 birim), β-Galaktoz (1165 birim), α2,6 bağlı sialik asit (764 birim), β-GlcNAc (672 birim) ve α-Mannoz (205 birim) şeklindedir. Reelin glikoproteininin saflaştırılması transfeksiyon yapılmamış hücrelerden immün çöktürme tekniği ile gerçekleştirilmiş ve 250 kDa'luk Reelin fragmanı saf olarak izole edilmiştir. Bu izolatın monosakkarit analizi sonucu, miktarları fazladan aza doğru sırasıyla; N-asetilgalaktozamin, N-asetilglukozamin, galaktoz, glukoz ve mannoz olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak, pek çok hastalık, glikokonjugatlardaki glikozilasyon değişmeleriyle ve/veya glikanların tanınmasıyla ilgili olarak ortaya çıkar. Reelin'in bir glikoprotein olduğunun bilinmesine karşın, glikan profiline ilişkin literatür bilgisi çok sınırlıdır. LC-MS/MS gibi yüksek analitik tekniklerle Reelin glikan analizleri, ilk kez gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, Reelin üretimi için transfeksiyon sistemi kullanılmadan doğal formda saflaştırma yapılması, olası glikan değişimlerini engellemesi açısından önemlidir ve literatürde rastlanmamıştır. Belirlediğimiz Reelin fragmanlarından 85 kDa'luk fragman da ilk kez ifade edilmiştir. Yüksek miktarda aminli glikan birimlerinin (GlcNAc ve GalNAc) belirlenmesi, Reelin üzerinde N-glikanların yanı sıra O-glikanların da önemli bir yerinin olabileceğini göstermektedir. Bu sonuçların ve devamında yapılacak çalışmaların, nöropsikiyatrik hastalıkların mekanizmasının daha detaylı anlaşılmasına ve glikobiyoloji bakış açısıyla bu hastalıkların teşhis ve tedavisi için yapılan araştırmalara katkı sağlaması beklenmektedir.

Özet (Çeviri)

Reelin is a highly conserved extracellular glycoprotein that have an importance in neural development. There is many research related with neural disease originate from dysfunction of Reelin protein and mutation of RELN gene. However, the information about the glycans in the structure of reelin is very limited as well as no information about the possible roles of glycans in the disease. Different units of glycan in the structure of glycoproteins can control their function by altering the microenvironment of proteins. Thus, they act to function directly or indirectly in almost all functions of the cell. It is highly probable that the glycan chains of the Reelin glycoprotein also have an effect on its function since the glycosylation changes in the two proteins with the same amino acid sequences can directly alter the protein's function. In this thesis, it is aim to isolate of the Reelin glycoprotein and its important fragments from SH-SY5Y neuroblastoma cell line and to characterize of glycans profiles of these isolates by lectin blotting and structure (monosaccharide) analysis of these by CapLC-ESI-MS/MS. For this aim, SH-SY5Y neuroblastoma cell line was used. Total and cytoplasmic protein extractions were carried out after cells were grown in appropriate conditions. Band / bands belong to Reelin were determined using Western blotting. Lectin blotting was carried out using SNA, MAA, GNA, PNA and DSA lectins to determine the terminal units of glycan on the Reelin bands. Reelin glycoprotein was isolated from the cell line using an immunoprecipitation technique. Monosaccharide analysis of the isolated Reelin fragment was performed using the CapLC-ESI-MS/MS system. The total protein profile of the SH-SY5Y neuroblastoma cell line was demonstrated by SDS-PAGE using three different lysis buffers (Ripa, NucBuster, IP-lysis) and very similar results were obtained in all three cases. Reelin was obtained in the form of four fragments with weight of 400, 310, 250 and 85 kDa. α2,3 and α2,6 bound sialic acids, β-Galactose, α-Mannose, β-GlcNAc were determined in the fragments of Reelin glycoprotein as terminal unit of glycan. The highest value in terms of band area density was found to be 601 units in the α2,3 linked sialic acid band of the 400 kDa fragment of Reelin. Total value of band areas in the four fragments of Reelin were α2,3 linked sialic acid (1224 unit), β-Galactose (1165 unit), α2,6 bound sialic acids (764 unit), β-GlcNAc (672 unit), α-Mannose (205 unit) respectively. Purification of the Reelin glycoprotein was performed by immunoprecipitation from not transfected cells and Reelin fragment with weight of 250 kDa was isolated in pure form. In the result of the monosaccharide analysis of this isolate, N-acetylgalactosamine, N-acetylglucosamine, galactose, glucose and mannose were determined from high amount to low respectively. As a result, there are many diseases associated with alteration of glycosylation and/or recognition dysfunctions of glycans. Although Reelin is a glycoprotein, literature on glycan profile of Reelin is very limited. Glycan analysis of Reelin with high analytical techniques, LC-MS/MS, was performed for the first time. In addition, purification of the natural form without the use of transfection system to produce reelin is important for preventing possible glycan changes and not been found in the literature. The 85 kDa from the determined Reelin fragment was also shown for the first time. Determination of high amounts of aminoglycans (GlcNAc and GalNAc) demonstrate that N-glycans as well as O-glycans may be an important on Reelin. It is expected that these results and future studies will contribute to detailed understanding of the mechanism of neuropsychiatric diseases and to the research done for diagnosis and treatment of the diseases from the viewpoint of glycobiology.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    887065

    In Vitro evaluation of protective effects of phillyrea latifolia extracts against oxidative stress and inflammation on co-cultured neuronal cell line SH-SY5Y

    Phillyrea latifolia ekstraktlarının oksidatif stres ve inflamasyona karşı In Vitro koruyucu etkilerinin ortak kültürlenen nöral hücre hattı SH-SY5Y üzerinde değerlendirilmesi

    DİLARA GÜREŞÇİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Farmasötik ToksikolojiYeditepe Üniversitesi

    Farmasötik Toksikoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HANDE SİPAHİ

  2. Tez No

    661904

    Creating a 3D neuronal-culture using alginate and collagen hydrogels optimal for neuronal survival and axon growth

    Aljinat ve kolajen hidrojeli ile 3B hücre kültürünün nöronal sağkalım ve akson uzaması için optimizasyonu

    BAŞAK DALBAYRAK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    BiyomühendislikBoğaziçi Üniversitesi

    Biyomedikal Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NAİME HALE SAYBAŞILI

    PROF. DR. IŞIL KURNAZ

  3. Tez No

    579774

    Analysis of functional domains of alternative splicing isoforms

    NFIB alternatif kırpılma izoformlarının işlevsel bölgelerinin analizi

    ŞEYMA VARINCA

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR

  4. Tez No

    496321

    Investigation of the interaction between NFI and its potential interaction partner BRG1

    NFI proteininin potansiyel etkileşim partneri olan BRG1 ile etkileşiminin araştırılması

    SELİM TÜRKEL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ASLI KUMBASAR

  5. Tez No

    438666

    Characterization of stem like cells in a new astroblastoma cell line

    Yeni bir astroblastoma hücre hattında kök hücre karakterizasyonu

    ESRA AYDEMİR ÇOBAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyoteknolojiYeditepe Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FİKRETTİN ŞAHİN

Geri Dön