Geri Dön

Molecular cloning and production of recombinant hODF extracellular domain

Rekombinant hODF ekstrasellüler domain'in moleküler klonlanması ve üretimi

PDF İndir

  1. Tez No: 547167
  2. Yazar: MUHAMMET MEMON
  3. Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. MUHAMMED KASIM DİRİL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Tıbbi Biyoloji, Biyoloji, Biotechnology, Medical Biology, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Nükleer faktör-kappa B, Osteoklastlar, Rekombinant protein üretimi, Rekombinasyon-genetik, Reseptörler, Nuclear factor-kappa B, Osteoclasts, Recombinant protein production, Recombination-genetic, Receptors
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
  10. Enstitü: İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.

Özet

İnsan osteoklast değişim faktörü (hODF), osteoblastlar tarafından üretilen membrane proteinidir. Proteolitik olarak kesilmesiyle 143-317 amino asitlerden oluşan kesik-ekstraselüler domainini açığa çıkarır. hODF ekstraselüler domaini osteoclast membranındaki reseptörü olan RANK'e bağlanır ve aktive eder. Aktive edilmiş RANK, NF-KB'nin aktivasyonuna ve hücre çekirdeğine lokalize olmasına sebep olan hücre içi sinyal yolağını tetikler ve osteoklastogenik genlerin transkripsiyonuna sebep olur. Bu nihayetinde osteoklastların farklılaşmasını ve aktivasyonu ile sonuçlanır ki bu da kemikleri yeniden biçimleme yanıtıdır. Osteoklast oluşumunu in vivo ve in vitro olarak çalışabilmek için yeteri miktarda hODF proteinine ihtiyaç duyulur ki ilerki basamaklarda RAW264.7 osteoklast oluşum deneyinde ve in vitro bağlanma testlerinde kullanılabilsin. Bu yüzden biz rekombinant hODF ekstraselüler domainini ekspresyonuna ve saflaştırılmasına karar verdik. Rekombinant hODF, insan hücresinden elde edilen genomic DNAdan oluşturuldu ve moleküler klonlama yöntemleriyle birkaç ekspresyon vektörlerine klonlandı. Farklı saflaştırma statejilerinin denenmesi ve optimize edilmesinden sonra, GST tag edilmiş hODF bakterilerin içinde ekspres edilip glutatyon-agaroz boncuklarıyle saflaştırıldı. hODF, HRV3C proteazı ile boncuklardan ayırıldı ve sonuçlar SDS-PAGE ile analiz edildi. Geliştirdiğimiz protokol ile yaklaşık milligram miktarlarında ve %70 saflıktan daha fazla düzeyde hODF üretildi.

Özet (Çeviri)

Human osteoclast differentiation factor (hODF) is a membrane protein expressed by osteoblasts. Its proteolytic cleavage releases a truncated ecto-domain composed of its extracellular domain between amino acids 143-317. hODF extracellular domain, binds to and activates its receptor RANK on osteoclast membrane. Activated RANK triggers an intracellular signaling pathway which leads to activation and nuclear localization of NF-KB and transcription of osteoclastogenic genes. This eventually results in differentiation and activation of osteoclasts, eliciting a bone remodeling response. To study osteoclastogenesis in vivo and in vitro requires a significant amount of hODF protein which can be used in downstream experiments such as RAW264.7 osteoclastogenesis assay and in vitro binding assays. Therefore, we decided to express and purify recombinant hODF extracellular domain. Recombinant hODF DNA was generated from human cellular genomic DNA and cloned into several expression vectors by PCR based molecular cloning methods. After trial and optimization of different purification strategies, GST tagged hODF was expressed in bacterial cells and purified by glutathione–agarose beads. hODF was released from the beads by proteolytic cleavage by HRV3C protease and results were analyzed by SDS-PAGE. The protocol we developed enabled us to produce sub-milligram quantities of hODF with higher than %70 purity.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    552879

    Molecular cloning and recombinant production of human (EpCAM) extracellular domain

    İnsan EpCAM'ın ekstrasellüler bölgesinin moleküler klonlanması ve rekombinant üretimi

    ELSAYED NABIL ELSAYED HASSAN ZAABOUT

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    BiyoteknolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HÜLYA AYAR KAYALI

  2. Tez No

    394619

    Isolation and characterization of a novel tyrosinase enzyme from native bacterial straine, production of the enzyme by cloning, characterization of the recombinant enzyme and analysis of its biotechnological applications such as production of l-dopa and melanin

    Doğal bakteri suşlarından tirozinaz enzim izolasyonu, karakterizasyonu, üretici genin klonlanması, rekombinant enzimin karakterizasyonu ve l-dopa ve melanin üretimi gibi biyoteknolojide kullanılabilirliği

    EBRAHİM VALİPOUR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2015

    MikrobiyolojiÇukurova Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BURHAN ARIKAN

  3. Tez No

    706953

    Cloning, expression and characterization of sericin like octamer-repeat protein

    Serisin benzeri oktomer tekrarlı bir proteinin klonlanması, ekpresyonu ve karakterizasyonu

    ALPER ŞAHİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NUR BAŞAK SÜRMELİ ERALTUĞ

  4. Tez No

    629325

    Recombinant production of a glycosidase by using an in-vivo cloning system and its immobilization via different strategies

    Hücre içi klonlama sistemi kullanarak rekombinant glikosidaz üretimi ve immobilizasyonu

    BURCU PEKDEMİR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    BiyoteknolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyomoleküler Bilimler Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. SERCAN KARAV

  5. Tez No

    939164

    APP geni ekzon 16 ve 17 bölgesinin klonlanması ve protein izolasyonu

    Cloning and the protein isolation of APP gene exone 16 and 17 region

    GÖNÜL AKMEŞE

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2025

    BiyoteknolojiSelçuk Üniversitesi

    Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ EBRU MARZİOĞLU ÖZDEMİR

Geri Dön