Azurin proteininin Pichia pastoris ile rekombinant üretimi
Recombinant production of azurin protein by Pichia pastoris
- Tez No: 549411
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ YAĞMUR ÜNVER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Genetics, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Atatürk Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 88
Özet
Bu çalışmada Pichia pastoris ekspresyon sisteminde sıklıkla kullanılan ve metanolle indüklenebilen AOX (alkol oksidaz) promotörünün kontrolü altında azurin proteininin üretimi gerçekleştirilmiştir. Pseudomonas aeruginosa genomik DNA'sı kullanılarak amplifiye edilen ve pPICZαA ekspresyon vektörüne yerleştirilen azurin geni, E. coli One Shot TOP10 hücrelerinde klonlanmış ve lineer hale getirilen rekombinant vektör, P. pastoris X-33 hücrelerine transfer edilmiştir. Genomlarında azurin geninin çoklu kopyasını taşıyan kolonilerin seleksiyonu için antibiyotik direnç testi ve koloni PCR reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Seçilen rekombinant transformantların protein üretim kapasiteleri karşılaştırılmıştır. Katı besiyerinde 48-72 saat inkübasyona bırakılan hücreler, gliserol içeren ön kültür besiyerlerine inoküle edilmiştir. İnkübasyon sonrası santrifüjle çöktürülen hücreler, %0,5 metanol ve %1 sorbitol içeren üretim besiyerlerine aktarılarak 48 saat boyunca çalkalamalı inkübasyona bırakılmıştır. 24 saat sonra kültür ortamlarına promotör indükleyicisi olarak %0,5 metanol ilave edilmiştir. İnkübasyon sonrası elde edilen kültür süpernatantları ve hücre lizatları ile gerçekleştirilen Western blot analizi ile transformantların tümünde rekombinant proteinin hem ekstrasellüler hem de intrasellüler üretimi gözlenmiştir. Ayrıca her iki üretim tipine göre, 1. koloniyi oluşturan hücrelerin protein üretim kapasitesinin diğer kolonileri oluşturan hücrelerin üretim kapasitesinden daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Rekombinant P. pastoris hücreleri tarafından üretilen ekstrasellüler azurin proteininin molekül kütlesinin yaklaşık 20 kDa olduğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada, P. pastoris hücrelerinde azurin proteininin ekspresyonu ilk kez gerçekleştirilmiştir.
Özet (Çeviri)
In this study, the production of azurin protein under the control of the AOX (alcohol oxidase) promoter, which is frequently used in the Pichia pastoris expression system and can be induced by methanol, was performed. The azurin gene amplified using the Pseudomonas aeruginosa genomic DNA and inserted into the pPICZαA expression vector was cloned in E. coli One Shot TOP10 cells and linearized recombinant vector was transferred to the P. pastoris X-33 cells. Antibiotic resistance test and colony PCR reaction were performed for the selection of colonies containing multicopy of the azurin gene in their genomes. Protein production capacity of selected recombinant transformants was compared. The cells incubated for 48-72 hours in solid medium were inoculated into pre-culture media containing glycerol. After incubation, centrifuged cells were transferred to the production media containing 0.5% methanol and 1% sorbitol, and incubated for 48 hours. After 24 hours, 0.5% methanol, as promoter inducer, was added to the culture media. Both extracellular and intracellular production of the recombinant protein was observed in all of the transformants by Western blot analysis performed using culture supernatants and cell lysates which were obtained after incubation. In addition, according to both types of production, it was observed that the protein production capacity of the cells constituting the 1st colony was higher than the production capacity of the other colonies. The molecular mass of the extracellular azurin protein produced by recombinant P. pastoris cells was found to be about 20 kDa. Expression of azurin protein in P. pastoris cells was performed for the first time in this study.
Benzer Tezler
- Pichia pastoris'te kendinden indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sisteminin geliştirilmesi
Improvement of a self-inducible heterologous protein expression system in Pichia pastoris
BETÜL ARI
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ YAĞMUR ÜNVER
- Azurinin Lactococcus lactis'te rekombinant üretimi, antimikrobiyal ve sitotoksik etkisinin araştırılması
Recombinant production of azurin in Lactococcus lactis, investigation of its antimicrobial and cytotoxic effects
MELİKE YILDIZ
Doktora
Türkçe
2018
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HAKAN AŞKIN
- Komagataella phaffii'de ısı ile indüklenebilir bir heterolog protein ekspresyon sisteminin geliştirilmesi ve azurin proteininin üretimi
Improvement of a heat-inducible heterologous protein expression system and production of azurin protein in Komagataella phaffii
İBRAHİM DAĞCI
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YAĞMUR ÜNVER
PROF. DR. AHMET MAVİ
- Lokal Pseudomonas suşundan antikanser proteini kodlayan azurin genini (AZU) moleküler tarama ve klonlama
Molecular screening and cloning the azurin gene (AZU) encoding anticancer protein from local Pseudomonas strain
SHAYMAA FADHIL ABBAS AL-ANBAGI
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyomühendislikKırşehir Ahi Evran Üniversitesiİleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MURAT ÇANLI
DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULAMEER M. GHAREEB
- Manyetofeksiyon yöntemiyle transfer edilen azurinin MCF-10A hücrelerinde heterolog ekspresyonu
Heterologous expression of azurin transferred by magnetofection method in MCF-10A cells
SAADET KALAKENGER
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ YAĞMUR ÜNVER