Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinde PKNOX2 proteinin ATM ve RNF8 ile etkileşimlerinin incelenmesi
Investigation of PKNOX2 protein interactions with ATM and RNF8 in bone marrow derived mesenchymal stem cells
- Tez No: 581258
- Danışmanlar: PROF. DR. AYŞEN ÖZCAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Moleküler Tıp, Tıbbi Biyoloji, Biochemistry, Molecular Medicine, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kök Hücre Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 83
Özet
Son araştırmalar transkripsiyon faktörü PKNOX2'nin tümör baskılayıcı bir protein olduğunu ve Fanconi anemisi hastalarının kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinde (Kİ-MKH'lerinde) azaldığını göstermiştir. Günel-Özcan grubunun yayınlanmamış çalışmasında PKNOX2 ko-immunopresipitasyon sonrası proteom analiz listesinde PKNOX2'nin etkileştiği proteinler arasında ATM ve RNF8 proteinlerinin düşük 'coverage' değeri ile saptanmış olması PKNOX2'nin DNA onarım yolağında rol oynayabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmanın amacı bu hipotezi test etmek için, PKNOX2 proteini ile ATM ve RNF8 proteinlerinin etkileşimini doğrulamak ve bu etkileşimin DNA hasarı ile durumunu Kİ-MKH'lerinde araştırmaktı. Etkileşimlerin doğrulanması için Kİ-MKH'lerine PKNOX2 overekspresyon plazmidi elektroporasyon ile aktarıldı ve protein izolasyonu sonrası, ko-immunopresipitasyon ve Western blotlama yapıldı. Ko-IP sonrası Western Blot analizleriyle PKNOX2 ile ATM etkileşimi doğrulanırken, IgG heavy chain kirliliği olabileceği değerlendirmesi PKNOX2 ile ATM veya RNF8 etkileşiminin varlığı in situ proximity ligation assay (PLA) ile gerçekleştirilmiştir. PLA yöntemiyle bu etkileşimlerin hem sitoplazma hem çekirdek içinde olduğu saptanmıştır. DNA hasarı durumunda etkileşimleri incelemek için ɣ-irradiye edilen Kİ-MKH'lerde DNA hasarı oluştuğu akım sitometri yöntemiyle doğrulanmıştır. PI boyaması ile yapılan akım sitometri analizlerinde hücre döngüsü piklerinde keskin ayrışma olmadığından kesin sonuca varılamamakla birlikte DNA hasarına uğrayan hücrelerin G2 fazında tutuklandığı bulunmuştur. ɣ-irradyasyon ile DNA hasarına uğrayan hücrelerde PLA, PKNOX2 ile ATM etkileşimini gösterememiştir ancak PKNOX2-RNF8 etkileşimi artmıştır. Sonuç olarak PKNOX2 transkripsiyon faktörünün ATM ve RNF8 ile etkileştiği literatürde ilk kez olarak gösterildi. DNA hasarı ile etkileşimlerdeki değişim daha ileri çalışmalar ile doğrulanmalıdır.
Özet (Çeviri)
Recent research has shown that the transcription factor PKNOX2 is a tumor suppressor protein and decreases in bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BM-MSCs) of Fanconi anemia patients. In the previous unpublished study of Günel-Özcan Group, it was suggested that PKNOX2 may play a role in the DNA repair pathway due to the low 'coverage' of ATM and RNF8 proteins in the proteome analysis list obtained after PKNOX2 co-immunoprecipitation. The aim of this study was to confirm the interaction of PKNOX2 protein with ATM and RNF8 proteins in order to investigate the DNA damage and status of this interaction in BM-MSCs. To confirm the interactions, the PKNOX2 overexpression plasmid was transferred to BM-MSCs by electroporation, protein isolation was performed from these cells and, co-immunoprecipitation and Western blotting were performed. While PKNOX2 and ATM interaction was confirmed by Western Blot analysis after co-IP, PKNOX2 and ATM or RNF8 interactions was also confirmed by in situ proximity ligation assay (PLA) due to IgG heavy chain contamination possibility. These interactions were determined by PLA method both in the cytoplasm and in the nucleus. In order to examine the changes in the interactions with DNA damage, DNA damage was detected by flow cytometry in ɣ-irradiatiated. In the flow cytometry analyses performed with PI staining, it was thought that the cells damaged DNA were arrested in the G2 phase, although it was not possible to conclude that there was no sharp dissociation in the cell cycle peaks. In situ proximity ligation assay did not detect PKNOX2 and ATM interaction in ɣ-irradiated cells but increase in PKNOX2-RNF8 interaction was observed. In conclusion, it was shown for the first time in the literature that PKNOX2 transcription factor interacts with ATM and RNF8. Changes in interactions with DNA damage should be confirmed by further studies.
Benzer Tezler
- Hox and tale transcription factors in fanconi anemia bone-marrow mesenchymal stem cells: Gene expression and protein interactions
Fankoni anemisi kemik iliği mezankimal kök hücrelerinde hox ve tale transkripsiyon faktörleri: Gen ifadeleri ve protein etkileşimleri
ILGIN ÇAĞNAN
- Investigating the effects of PKNOX2 and its interactors in P53 pathway regulation in bone marrow mesenchymal stem cells
Kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinde P53 yolağı regülasyonunda PKNOX2 ve etkileşimlerinin araştırılması
MUSTAFA KELEŞ
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyokimyaHacettepe ÜniversitesiKök Hücre Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYŞEN ÖZCAN
- DMBA ile uyarılan kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinde konneksin 43 üretimi üzerine çinko ve BMP2'nin etkisi
The effect of zinc and BMP2 on connexin 43 production in bone marrowmesenchymal stem cell induced by DMBA
KEMAL YÜCE
Doktora
Türkçe
2019
FizyolojiSelçuk ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ABDULKERİM KASIM BALTACI
- Biyoaktif alkalen fosfataz taklidi nano yapıların geliştirilmesi
Development of bioactive alkalene phosphatase mimetic nano structutres
DİLARA YENİTERZİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiKonya Gıda ve Tarım ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ GÜLCİHAN GÜLSEREN
- Identification of small molecules that enhance murine bone marrow derived mesenchymal stem cell expansion
Fare kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücrelerinde çoğalmayı indükleyen küçük moleküllerin identifikasyonu
LAMİA YAZGI ALYAZICI
Yüksek Lisans
İngilizce
2018
BiyoteknolojiYeditepe ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATİH KOCABAŞ