Geri Dön

Analysis and characterization of the Pichia pastoris secretome for pharmaceutical protein production

Pichia pastoris sekretomunun farmasötik protein üretimi için analizi ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 584829
  2. Yazar: HATİCE PINAR KIRLI
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ HARUN KOKU, PROF. DR. PINAR ÇALIK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Kimya Mühendisliği, Biotechnology, Chemical Engineering
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2019
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 121

Özet

İnsan büyüme hormonu (hGH) çocuklarda kısa boyluluk tedavisinde kullanıldığı gibi pek çok hastalığın da tedavisinde kullanılmaktadır. hGH yüksek saflıkta kullanılabildiği için afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılmaktadır. Afinite kromatografisinin yüksek maliyetinden dolayı diğer kromatografik teknikler kullanılarak rekombinant insan büyüme hormonunun (rhGH) saflaştırılması araştırılmıştır. Çalışmanın amacı kromatografik saflaştırma protokollerini kullanarak rhGH'in Pichia pastoris üretim ortamından ayrılmasıdır. İlk olarak P. pastoris sekretomu iki boyutlu jel elektroforez ile analiz edildi. Sekretomda rhGH dışında molekül ağırlık aralığı 20 ila 140 kDa olan 4 ana protein bulundu. Sekretomdaki proteinlerin izoelektrik noktalarının 4.4 ve 5.7 arasında değiştiği belirlendi. Sekretomdaki proteinleri tanımlamak için literatürdeki P. pastoris sekretomu JVirGel 2.0 programı ile analiz edildi. Program sanal olarak sekretomun iki boyutlu jel elektroforez görüntüsünü oluşturdu. Deneysel jel sonuçlarını sanal görüntü ile karşılaştırınca deneysel bantların olası kimlikleri paf1 kompleks bileşeni, hücre duvarı protein DAN4, protein fosfotaz, lektin gibi protein, glukanazlar, protein kinaz, aspartik proteinaz 3, asit fosfotaz olarak önerildi. Sekretomdaki proteinlerin karakterizasyonundan sonra rhGH saflaştırılması tuz giderici kolon, jel geçirgenlik kolonu ve anyon değişim kolonu kullanılarak araştırıldı. Tuz giderici kolonda sekretomdaki proteinler tuz ve peptit parçaları gibi safsızlıklardan ayrıldı. rhGH'in jel geçirgenlik kolonu kullanılarak molekül ağırlığı 15 kDa olan proteinlerden kısmi olarak saflaştığı görüldü. rhGH'in sekretomdaki diğer proteinlerle etkileşip topak oluşturduğu tahmin edilmektedir. rhGH'in arka arkaya iki kromatografik teknik kullanılarak kısmi olarak saflaştırılması mümkün olsa da ayrım düşük verimle gerçekleşmektedir. Art arda iki kromatografik teknik kullanımının önemli miktarda protein kaybına neden olduğu düşünülmektedir. Bu çalışmada son olarak iki farklı promotör kullanılarak ürettirilen sekretomlar rhGH'in saflaştırması açısından birbirleriyle karşılaştırıldı. Jel geçirgenlik ve iyon değişim kolonundan alınan fraksiyonlar SDS-PAGE ile incelendi. rhGH konsantrasyonunun modifiye GAP ile üretilen sekretomda modifiye AOX ile üretilene göre daha yüksek olması dışında büyük bir fark gözlenmedi. Sonuç olarak rhGH jel geçirgenlik ve iyon değişim kolonu kullanılarak kısmi olarak saflaştırıldı.

Özet (Çeviri)

Human growth hormone (hGH) is used for the treatment of many diseases like short stature in children. It is generally purified by using affinity chromatography. Due to the high cost of affinity chromatography, other chromatographic techniques have been investigated for purification of recombinant human growth hormone (rhGH). The aim of this work was to explore chromatographic purification protocols for rhGH from the secretome of Pichia pastoris. First, the entire secretome was examined by 2-D gel electrophoresis. A major 4 unique proteins apart from rhGH were found in the secretome. The molecular weights of the other proteins were found to range between 20 and 140 kDa. The isoelectric points of most of the proteins in secretome were determined to vary between 4.4 and 5.7. To putatively identify the proteins in the secretome, the secretome of P. pastoris from the literature was analyzed using the software JVirGel 2.0, which forms a virtual 2D gel image. By comparing the virtual image with the experimental gel results, the possible identities for the experimental bands were suggested as the paf1 complex component, cell wall protein DAN4, protein phosphatase, lectin-like protein, putative glucanases, protein kinase, aspartic proteinase 3, repressible acid phosphatase. After the characterization of the secretome proteins, the purification of rhGH was investigated using desalting, size exclusion and anion exchange chromatography. In the desalting column, proteins were separated from impurities like salts and peptide parts. It was found that using size exclusion chromatography, the rhGH was partially purified from proteins with molecular weight lower than 15 kDa. It was predicted that rhGH interacts with other proteins and forms agglomerates. Although partial purification of rhGH is possible by using consecutive usage of two chromatographic techniques, the separation yield is low, since sequential chromatographic techniques probably caused substantial protein loss. As the final investigation of this work, secretomes produced by two different promoters were compared for purification of rhGH. Fractions of size exclusion and anion exchange chromatography were analyzed by SDS-PAGE. It was found that the secretomes were mostly similar except for the fact that the rhGH concentration of the secretome with the modified GAP promoter was higher than that for the secretome with modified AOX. In conclusion, rhGH was partially purified by using size exclusion and anion exchange chromatography.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    558728

    Hematopoetik hücrelerin üretilmesi, çoğaltılması ve farklılaşmasında görevli epo ve tpo'nun medikal biyoteknolojik ürün olarak üretilmesi, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Production, propagation and differentiation of hematopoetic cells producing, purification and characterization of epo and tpo as medical biotechnological product

    DUYGU DÜZGÜN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    BiyomühendislikTokat Gaziosmanpaşa Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SEÇİL ERDEN TAYHAN

  2. Tez No

    334968

    Pichia pastoris MIG1 geninin moleküler ve fonksiyonel karakterizasyonu

    Molecular and functional characterization of Pichia pastoris MIG1 gene

    SEMİRAMİS YILMAZ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyolojiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHMET İNAN

  3. Tez No

    450935

    Cloning of a cDNA encoding laccase from coriolopsis polyzona MUCL 38443 and expression in Pichia pastoris

    Coriolopsis polyzona MUCL 38443'ten lakkaz kodlayan bir cDNA'nın klonlanması ve Pichia pastoris'te ifade edilmesi

    ORKUN PİNAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN KARATAŞ

  4. Tez No

    621946

    Pichia pastoris'te rekombinant bakteriyel alfa amilaz üretimi

    Production of recombinant bacterial alpha amylase in Pichia pastoris

    ŞEYDA GÜLLÜ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Gıda MühendisliğiAkdeniz Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET İNAN

  5. Tez No

    816504

    Evaluation of pichia pastoris as a microbial cell factory for production of fungal antimicrobial proteins

    Fungal antimikrobiyal proteinlerin üretimi için bir mikrobiyal hücre fabrikasi olarak pichia pastoris'in değerlendirilmesi

    BUSEL ÖZCAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyoteknolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi

    Medikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. GÜNSELİ BAYRAM AKÇAPINAR

Geri Dön