Rekombinant geobacıllus kaustophılus L-asparajinaz II enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesi
Determination of kinetic properties of recombinant geobacillus kaustophilus L asparaginase II enzyme
- Tez No: 607160
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA İNCİ ÖZDEMİR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2019
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 69
Özet
L-asparajinaz (EC 3.5.1.1) asparajin amino asidinin aspartik asit ve amonyağa dönüşümünü sağlayan enzimdir. Tümör hücreleri asparajini sentezleyemediklerinden kan dolaşımındaki asparajini kullanırlar. Bu sebeple, L-asparajinaz çeşitli kan kanseri tiplerinde kemoterapötik ajan olarak kullanılmaktadır. L-asparajinaz aynı zamanda yüksek sıcaklıkta pişirilen gıda maddelerinde oluşan ve L-asparajinin öncül maddesi olduğu akrilamidin gideriminde de kullanılmaktadır. Hem ilaç hem de gıda sektöründe yüksek sıcaklık ve geniş pH aralığında aktivitesini kaybetmeyen L- asparajinaz türlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle ilgili tez çalışmasında, yüksek sıcaklıklarda yaşayan termofilik bakterilerden biri olan Geobacillus kaustophilus'a ait olan L-asparajinaz enziminin rekombinant olarak elde edilmesi ve kinetik ve termal kararlılık özelliklerinin çalışılması amaçlanmaktadır. Bu amaç doğrultusunda Geobacillus kaustophilus tip II L-asparajinaz geni pET22b(+) vektörüne BamHI-SalI enzim çifti kullanılarak klonlanmış ve E. coli Rosetta 2 (DE3) hücrelerinde ekspresyonu incelenmiştir. Gen ürününün N-terminalinde periplazmik lokasyonu sağlayan pelB sinyal dizisi ve C-terminalinde Hisx6 etiketi bulunması amaçlanmıştır. Böylelikle hücrede yüksek miktarda üretimi IPTG uyarımıyla sağlanan rekombinant L-asparajinaz enziminin periplazmik bölgede birikiminin enziminin saflaştırılmasına olan etkisinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. N-terminalinde pelB sinyal dizisi taşıyan L-asparajinazın E. coli hücrelerinde ifade edilmediği görülmüştür. Çalışmalara pelB sinyal dizisi taşımayan rekombinant L-asparajinaz ile devam edilmiştir. Enzim Ni-NTA agaroz ile tek basamakta saflaştırılmıştır. Saflaştırılan L-asparajinaz enziminin optimum aktivite gösterdiği 55°C sıcaklıkta ve pH 8.5'ta L-asparajin substratı için Km değeri 0.49 mM olarak hesaplanmış; L-glutamin substratı içinse Km değeri 2.5 mM olarak hesaplanmıştır. Yapılan termostabilite deneylerinde enzimin 37°C ve 55°C sıcaklıklarında aktivitesini 6 saat boyunca kaybetmediği görülmüştür.
Özet (Çeviri)
L-asparaginase (EC 3.5.1.1) is an enzyme that converts asparagine amino acid to aspartic acid and ammonia. Since tumor cells cannot synthesize asparagine, they use asparagine in the bloodstream. L-asparaginase has been used as a chemotherapeutic agent in various types of blood cancer. L-asparagine is the precursor of acrylamide formed in high-temperature foodstuffs. Therefore, L-asparaginase is used in the mitigation of acrylamide. L-asparaginases, which are stable in high-temperature and wide pH range, are needed in the pharmaceutical and food sectors. Therefore, our aim is to obtain the recombinant L-asparaginase enzyme belonging to a thermophilic bacteria Geobacillus kaustophilus, and to study its kinetic and thermostability properties. For this purpose, Geobacillus kaustophilus type-II L-asparaginase gene was cloned into the pET22b(+) vector using BamHI-SalI enzymes and its expression in E. coli Rosetta 2 (DE3) cells was examined. The pelB signal sequence providing the periplasmic location at the N-terminus of the gene product and the Hisx6 tag at the C-terminus was intended. Thus, it was aimed to compare the effect of the accumulation of recombinant L-asparaginase enzyme in the periplasmic region on the purification of the enzyme. L-asparaginase bearing the pelB signal sequence at the N-terminal was not expressed in E. coli cells. The studies were continued with recombinant L-asparaginase without the pelB signal sequence. The enzyme was purified with Ni-NTA agarose. Km value for L-asparagine is 0.49mM at 55°C and pH 8.5, Km value for L-glutamine is 2.5mM. Thermostability experiments showed that the enzyme kept its activity at 37°C and 55°C for 6 hours.
Benzer Tezler
- Termofilik Geobacıllus Kaustophılus L-asparajinaz enziminin klonlanması, karakterizasyonu ve antitümör etkisinin belirlenmesi
Cloning, characterization and identification of antitumor activity of thermophilic Geobacillus Kaustophilus L-asparaginase
MÜGE DİDEM ORHAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA İNCİ ÖZDEMİR
- Discovery of novel enzymes using proteomic approaches
Proteomik yaklaşımlar kullanılarak yeni enzimlerin keşfi
MERVE ÖZTUĞ KILINÇ
Doktora
İngilizce
2021
Biyokimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEVİN GÜL KARAGÜLER
DOÇ. DR. MÜSLÜM AKGÖZ
- Rekombinant Geobacillus kaustophilus Lon proteininin E. coli'den saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Purification and characterization of rekombinant Geobacillus kaustophilus Lon protein from E. coli
HATİCE ZİŞAN ASAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. F. İNCİ ÖZDEMİR
- Rekombinant Geobacillus kaustophilus HslV ve HslU proteinlerinin E. coli' den saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Purification and characterization of recombinant Geobacillus kaustophilus protein HslV and HslU from E. coli
GONCA ALTIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2009
BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR
- Geobacillus kaustophilus fosfotransasetilazın rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu
Geobacillus kaustophilus phosphotransacetylase: Recombinant production and biochemical characterization
MERAL AMANVERMEZ KARABAŞ