Rekombinant Geobacillus kaustophilus Lon proteininin E. coli'den saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Purification and characterization of rekombinant Geobacillus kaustophilus Lon protein from E. coli
- Tez No: 290182
- Danışmanlar: YRD. DOÇ. DR. F. İNCİ ÖZDEMİR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 112
Özet
Hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde protein yıkımı büyük oranda ATP-bağımlı proteazlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Lon proteaz bütün canlı organizmalarda bulunan yegane ATP-bağımlı proteazdır ve birçok hücre içi kontrol noktasında önemli rol oynamaktadır. Bununla beraber Lon proteazın proteolitik aktivitesi ve çeşitli substratları nasıl tanıyabildiği hala tam olarak açık değildir. Farklı organizmalardan yeni Lon proteazların izole edilmesi ve bu enzimlerin biyokimyasal ve genetik nitelendirilmelerinin yapılması, hem bu özgün proteaz sisteminin hücre içinde oynadığı biyolojik rolün, hem de protein hidroliz mekanizmasının anlaşılmasına yarar sağlayacaktır. Bu çalışmada G. kaustophilus`a ait lon geni pET-28a(+) vektörüne altklonlama ile aktarılmıştır. Gk-Lon proteaz, N-terminal bölgesine 6xHis kuyruk ekli şekilde E. coli BL21(DE3) hücrelerinde yüksek oranda eksprese edildikten sonra, Ni-NTA IMAC yöntemi ile saflaştırılmış ve biyokimyasal nitelendirilmesi gerçekleştirilmiştir. 6xHis eklentili Gk-Lon proteazın moleküler büyüklüğü SDS-PAGE`de yaklaşık 103 kDa olarak belirlenmiştir. Gk-Lon bir kimotripsin benzeri serin proteaz substratı olan Glt-Ala-Ala-Phe-MNA'yı etkin bir şekilde hidrolize etmiştir, ancak treonin proteaz substratını yıkıma uğratamamıştır. Gk-Lon ATP-bağımlı bir proteazdır, ancak ATP yokluğunda da peptit hidrolizi gerçekleştirebilmiştir. Gk-Lon peptidaz aktivitesi için Mg2+'a ihtiyaç duymaktadır, peptidaz aktivitesinin maksimum seviyede olabilmesi için ise, hem ATP hem de Mg2+'un bir arada olması gerekmiştir. ADP enzimin peptidaz aktivitesini inhibe etmiştir. Gk-Lon peptidaz aktivitesi için optimum sıcaklık 55ºC ve optimum pH 8.5 olarak belirlenmiştir. Gk-Lon peptidaz aktivitesi PMSF ve laktasistin ile inhibe olmuştur. Gk-Lon proteaz bir protein substrat olan ?-kazeini ATP-bağımlı ve bağımsız olarak hidroliz etmiştir. Gk-Lon ATPaz aktivitesi de göstermektedir. Protein yıkımı Gk-Lon ATPaz aktivitesini arttırırken, tetrapeptitler aktivitenin azalmasına sebep olmuştur. Mg2+'un, ?-kazein proteininin ve artan ATP konsantrasyonunun ATPaz aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
Both in prokaryotic and eukaryotic cells, protein degradation is carried out by ATP dependent proteases. Lon protease is a unique ATP-dependent protease found in all living organisms and plays important role in many control mechanisms in the cells. However proteolytic activity and substrate recognition of Lon protease is still unclear. Isolation of new Lon proteases from different organisms and their biochemical and genetic characterization will provide to understand biological role of this specific protease system and protein hydrolysis mechanism in the cells. In this study, lon gene from G. kaustophilus was subcloned into pET-28a(+) expression vector. Gk-Lon protease with N-terminal 6xHis-tag was overexpressed in E. coli BL21(DE3) cells, then purified by Ni-NTA IMAC method and biochemically characterized. Molecular weight of the 6xHis-tagged Gk-Lon protease was determined by SDS-PAGE as ~103 kDa. Gk-Lon protease efficiently hydrolyzed Glt-Ala-Ala-Phe-MNA, a substrate of trypsin-like serine proteases; however substrate of threonin proteases was not hydrolyzed. Gk-Lon protease is an ATP-dependent protease, but also peptidase activity was observed in the absence of ATP. Gk-Lon protease requires Mg2+ cation for peptidase activity but maximum enzyme activity requires presence of both ATP and Mg2+. Gk-Lon peptidase activity was inhibited by ADP. Optimum temperature for Lon protease activity was observed at 55ºC and optimal pH determined at 8.5. Gk-Lon peptidase activity was inhibited by PMSF and lactacystin. Gk-Lon protease degraded ?-casein, as a protein substrate, ATP-dependent and independent manner. Gk-Lon also showed ATPase activity. Gk-Lon ATPase activity was stimulated by protein substrates, but not tetrapeptides. Mg2+, ?-casein protein and increasing amounts of ATP concentrations stimulated ATPase activity of Gk-Lon.
Benzer Tezler
- Rekombinant geobacıllus kaustophılus L-asparajinaz II enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesi
Determination of kinetic properties of recombinant geobacillus kaustophilus L asparaginase II enzyme
ZEYNEP TANSU ATASAVUM
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyoteknolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA İNCİ ÖZDEMİR
- Rekombinant Geobacillus kaustophilus HslV ve HslU proteinlerinin E. coli' den saflaştırılması ve nitelendirilmesi
Purification and characterization of recombinant Geobacillus kaustophilus protein HslV and HslU from E. coli
GONCA ALTIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2009
BiyolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. FATMA İNCİ ÖZDEMİR
- Geobacillus kaustophilus fosfotransasetilazın rekombinant üretimi ve biyokimyasal karakterizasyonu
Geobacillus kaustophilus phosphotransacetylase: Recombinant production and biochemical characterization
MERAL AMANVERMEZ KARABAŞ
- Geobacillus kaustaphilus alfa-galaktosidaz enziminin rekombinant protein olarak E. coli'de ifadesi ve karakterizasyonu
Expression and characterization of geobacillus kaustophilus alfagalactosidase enzyme as a recombinant protein in E. coli
ASLI KUŞ
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyomühendislikKafkas ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ YUNUS ENSARİ
- Termofilik Geobacıllus Kaustophılus L-asparajinaz enziminin klonlanması, karakterizasyonu ve antitümör etkisinin belirlenmesi
Cloning, characterization and identification of antitumor activity of thermophilic Geobacillus Kaustophilus L-asparaginase
MÜGE DİDEM ORHAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyolojiGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ FATMA İNCİ ÖZDEMİR