Geri Dön

Molecular studies on the cloning and expression of human beta interferon gene in E. coli

İnsan beta interferon geninin klonlanması ve E.coli'de ekspresyonu üzerine moleküler çalışmalar

PDF İndir

  1. Tez No: 609809
  2. Yazar: ZALİHE OMAY
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. MEHMET ÖZTÜRK
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2020
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Bolu Abant İzzet Baysal Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 85

Özet

Viral ve viral olmayan enfeksiyonlara yanıt olarak memelilerde birçok hücre tipi tarafından üretilen İnsan interferon beta (hIFNβ), bir immünoregülatör görevi görür ve multipl skleroz, astım, hepatit B ve C, insan papilloma virüsü gibi çeşitli hastalıklar ve çeşitli kanserler için önemli bir terapötik ilaç olma potansiyeline sahiptir. Moleküler boyutu nedeniyle recombinant IFNβ1b (rIFNβ1b) üretiminin klinik uygulamaları ve elverişliliği göz önüne alındığında, bu terapötik proteinin saf ve yüksek verimini sağlayabilecek düşük maliyetli bir üretim sistemi oluşturmak çok önemlidir. Prokaryotik sekresyon sistemleri, protein üretiminde proteinleri periplazmaya veya hücre zarının dışına ekspres olması için çoğunlukla tercih edilir. Böylece, ekspresyon sistemi, sonraki işlemleri basitleştirir ve protein yıkımını ve maliyetini azaltır. IFNβ1b ekspresyonu için oldukça arzu edilen ve özelleştirilebilir bir sistemdir. Türkiye'de yüksek fiyatlarla ithal edilen lisanslı yerli rekombinant protein üretimi henüz gerçekleştirilememiştir. E. coli hücrelerinin periplazmasına insan rIFNβ1b proteinini ekspres eden yeni vektörlerin yapımını tarif eden bazı raporlar vardır. Bu çalışmada, insan rIFNβ1b proteinini periplazmik bölgede ekspresyonu için, E. coli kodon tablosuna göre optimize edilmiş rIFNβ1b geni, biyoinformatik araçlarla elde edildi. Elde edilen gen, pelB sinyal peptidini içeren pET22b ekspresyon vektörüne klonlandı. Daha rIFNβb peptit sentezi, 25°C'de 0.4 mM IPTG ile indüklenen E. coli/BLR(DE)3 suşunda gerçekleştirildi ve daha sonra konağın ortamından, periplazmik ve sitoplazmik bölgesinden izole edilip Ni-NTA affinite kolon ile pufiye edildi. Recombinant IFNβ1b, (~ 18 kDa), üretimi %12 SDS-PAGE ve Western Blot analizi ile belirlenmiştir. Sonuçlarımız, optimize edilmiş IFNβ1b proteininin hücre içi çözünür ekspresyonunun gerçekleşmediğini gösterdi. Bu durum deneysel olarak doğrulanamamasına rağmen, uygun olmayan kodon optimizasyonu nedeniyle rIFNβ1b mRNA'ların katlanmış formunun üretildiğini ve bu yapının rIFNβ1b mRNA'ların çevrilmesini engellediğini düşünülmektedir. Prokaryotik sekresyon sisteminin yeniden yapılandırılması ve kodon optimizasyonları, rIFNβ1b proteininin daha uygun üretimini ve saflaştırılmasını geliştirebilir.

Özet (Çeviri)

Human interferon beta (hIFNβ), produced by many cell types in mammals in response to viral and nonviral infections, acts as an immunoregulator and have a potential to become an important therapeutic drug for several diseases such as multiple sclerosis, asthma, hepatitis B and C, human papillomavirus and various cancers. Considering the clinical applications and convenience of the rIFNβ production due to its molecular size, generating a low-cost production system, which could provide as much as pure and high yield of this therapeutic protein, is very important. Prokaryotic secretory systems are mostly preferred for the production in order to secrete proteins into the periplasm or out of the cell membrane. Thus, secretoy system simplifies the downstream processing and reduces the protein degradation and cost. It is a quietly desirable and customisable system for secretion of IFNβ1b. In Turkey, licensed domestic production of recombinant proteins, imported at high prices, has not been achieved. There are some reports describing the construction of novel vectors expressing human rIFNβ1b in the periplasm of the E. coli cells. In this study, for production of rIFNβ1b protein in periplasmic space, codon optimisated rIFNβ1b gene according to E. coli codon table was provided by in silico bioinformatic tools. The obtained gene was cloned into pET22b expression vector which contains the pelB signal peptide. Then recombinant IFNβ1b peptide synthesis was performed in E. coli/BLR(DE)3 strain induced with 0.4 mM IPTG at 25°C and then isolated from the medium, periplasmic and cytoplasmic space of the host and they were pufied with the Ni-NTA affinity colon. The production of the rIFNβ1b, (~18 kDa) was determined by %12 SDS-PAGE and Western Blot analysis. Our results indicated that the intracellular soluble expression of the optimized IFNβ1b protein did not take place. Eventhough, this was not confirmed by experimetally, we thought that because of the improper codon optimization, folded form of rIFNβ1b mRNA was produced and this structure prevented the translation of rIFNβ1b mRNA. Reconstruction of the prokaryotic secretion system and codon optimizations may improve the more convenient production and purification of rIFNβ1b protein.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    318281

    ISG15 aktive edici e1 enzimi Ube1L-uf domaıninin NMR solüsyon yapısının belirlenmesi ve bazı insan ubiquitilasyon E3 enzimleri ve RIG-1-CARDs'ın klonlanması, ekspresyonu ve saflaştırılması

    NMR solution structure of ISG15 activating enzyme Ube1L uf-domain and cloning, expression, purification of some ubiquitin E3 enzymes and RIG-I CARDs

    ÇAĞDAŞ DAĞ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    BiyokimyaMuğla Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. EMİNE SONAY ELGİN

  2. Tez No

    153474

    Cloning and characterization of industrially important alpha-galactosidase genes from the human pathogen aspergillus fumigatus

    Alfa-galatosidaz genlerinin insan patojeni aspergillus fumigatusdan klonlaması ve karakterizasyonu

    BETÜL SÖYLER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2004

    Gıda MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. UFUK BAKIR

  3. Tez No

    653426

    Kemoterapi ajanı Doksorubisin'in Escherichia coli üzerindeki etkisi ve dirençle ilgili genlerin genom boyu kütüphane zenginleştirme ve tarama çalışmaları ile araştırılması

    Investigation of the effect of the chemotherapy agent doxorubicin on escherichia coli and the genes related to resistance by genome-wide library and screening studies

    ANI ALTUĞ CURNA

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Tıbbi BiyolojiAydın Adnan Menderes Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHTAP KILIÇ EREN

  4. Tez No

    368911

    Cloning and initial characterization of an estrogen responsive gene: YPEL2

    Östrojen yanıt geni YPEL2'nin klonlanması ve proteinin ilkin karakterizasyonu

    GİZEM GÜPÜR

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MESUT MUYAN

  5. Tez No

    878958

    Hepatosellüler kanserde MIR100HG'nin KLF7 transkripsiyon faktörü ile regülasyonu

    Regulation of MIR100HG by KLF7 transcription factor in hepatocellular carcinoma

    RÜMEYSA ALAÇAM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    GenetikBalıkesir Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FERAY KÖÇKAR

Geri Dön