Eritrosit galt enzim aktivitesinin belirlenmesi için LC-MS/MS metodu geliştirilmesi, optimizasyonu ve validasyonu
Development, optimization and validation of LC-MS/MS method for the determination of erythrocyte galt enzyme activity
- Tez No: 641817
- Danışmanlar: DOÇ. DR. EBRU SEZER
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2020
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ege Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 130
Özet
Amaç: Galaktozemi, genellikle galaktoz-1-fosfat üridil transferaz (GALT) eksikliğine bağlı gelişen bir karbonhidrat metabolizması hastalığıdır. GALT eksikliğinin tanısı eritrosit içi enzim aktivitesinin belirlenmesiyle mümkündür. Enzim aktivitesinin belirlenmesine yönelik birçok yöntem tanımlanmıştır. Radyoaktif yöntemler, zahmetli ve tehlikeli olduğu için tercih edilmemektedir. Florometrik yöntemler ise günümüzde tanı ve yenidoğan tarama programlarında en sık kullanılan yöntem olmasına rağmen analitik açıdan yetersiz kalmaktadır. Erken tanı ve tedavinin kritik olduğu bu hastalıkta, enzim aktivitesinin yüksek doğruluk ve güvenirlilik ile belirlenmesi, etkin bir tarama programı ve hastalığın ayırıcı tanısı için oldukça önemlidir. Bu çalışmada, hemolizat ve kuru kan damlası (KKD) örneklerinde GALT aktivitesinin tayinine yönelik, analitik açıdan güçlü, sıvı kromatagrafi-kütle spektrometri (LC-MS/MS) temelli bir yöntem geliştirilmesi; geliştirilen yöntemin valide edilmesi ve florometrik yöntem ile yöntem performansları açısından karşılaştırılması amaçlandı. Ayrıca yöntem için en uygun örnek toplama tüpünün belirlenmesi amacıyla K2EDTA'lı ve lityum heparinli örnek toplama tüplerinin enzim aktivitesine olan etkisi incelendi. Gereç ve Yöntem: Geliştirilen yöntemde izotop işaretli [13C6]-galaktoz-1-fosfat substrat, UDP-N-asetilglikozamin internal standart (İS) olarak kullanıldı. Kromatografik ayrıştırma, Acquity UPLC HSS T3 (1.8 µm, 2.1x50 mm) kolon ile sağlandı. 5 mM amonyum format içeren %50-%50 asetonitril/su çözgen sistemleri mobil faz olarak kullanıldı. Enzimatik reaksiyon sonucunda oluşan izotop işaretli [13C6]-UDP-Gal'un (571/323) kantitasyonu, İS (606/385) pik alanına göre sağlandı ve enzim aktivitesi hesaplandı. Yöntem validasyon parametreleri kapsamında ölçüm limitleri, geri elde, tekrarlanabilirlik, matriks etkisi, seçicilik, taşıma etkisi ve referans aralık çalışmaları yapıldı. Analiz için en uygun örnek tüpünün belirlenmesi ve yöntem performanslarının karşılaştırılması amacıyla, farklı antikoagülan içeren kan tüplerinden elde edilen hemolizat ve KKD örneklerinin enzim aktiviteleri belirlendi ve sonuçlar yorumlandı. Bulgular: Hemolizat örneklerinin GALT aktivitesinin ortalama±SD değeri 12.04±1.88, KKD örneklerinin 3.46±1.06 µmol/grHb/saat olarak belirlendi. Hemolizat yönteminde doğrusal aralık 0.4-100 µM (normalin %1.1-%280'i), KKD yönteminde 0.4-50 µM (normalin %2.4-%310'u) arasındaydı. Gün içi ve günler arası tekrarlanabilirlik çalışmalarında %varyasyon katsayısı (%CV) değerleri
Özet (Çeviri)
Aim: Galactosemia is a carbohydrate metabolism disease that usually develops due to galactose-1-phosphate uridyl transferase (GALT) deficiency. The diagnosis of GALT deficiency is possible by determining the intra-erythrocyte enzyme activity. Many methods for determining enzyme activity have been described. Radioactive methods are not preferred because they are laborious and threatening. Nowadays fluorometric methods are the most frequently used methods in diagnosis and newborn screening programs (NBS) although they are insufficient analytically. As early diagnosis and treatment is critical for galactosemia, determination of enzyme activity with high accuracy and reliability is crucial for an effective screening program and differential diagnosis of the disease. In this study, it was aimed to develop an analytically powerful liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS) based method for the determination of GALT activity in hemolysate and dried blood spot (DBS) samples, to validate the developed method and compare it with the performance of fluorometric method. In addition, the effect of K2EDTA and lithium heparin tubes on enzyme activity was examined in order to determine the most appropriate sample collection tube for the method. Material and Method: In the developed method, the isotope labeled [13C6]-galactose-1-phosphate as a substrate and UDP-N-acetylglycosamine was used as internal standard (IS). Chromatographic separation was achieved with Acquity UPLC HSS T3 (1.8 µm, 2.1x50 mm) column. 50%-50% acetonitrile/water solvent systems containing 5 mM ammonium format were used as mobile phase. Quantitation of the isotope labeled [13C6]-UDP-Gal (571/323) formed, as a result of the enzymatic reaction, was achieved according to the peak area of the IS (606/385) and enzyme activity was calculated. In the scope of method validation parameters, measurement limits, recovery, repeatability, matrix effect, selectivity, carryover and reference interval studies were performed. In order to determine the most appropriate sample collection tube for the analysis and to compare the performances of methods, the enzyme activities of both hemolysate and DBS samples obtained from blood tubes containing different anticoagulants were measured and the results were interpreted. Results: The mean±SD value for GALT activity of hemolysate samples was determined as 12.04±3.68 and 3.46±2.07 µmol/grHb/hour for DBS samples. The linear range was 0.4-100 µM (1.1-280% of normal) in the hemolysate method and 0.4-50 µM (2.4-310% of normal) in the DBS method. The %coefficient of variation (%CV) values were less than 15 for intra-day and inter-day repeatability studies. In recovery studies over 90% recovery was achieved. In general terms, ion suppression from matrix was not detected. While DBS samples were quite stable for 31 days under different storage conditions, hemolysate samples lost approximately 50% of enzyme activities at room temperature and +4 ˚C. Mean enzyme activity for DBS samples obtained from K2EDTA tubes was found approximately 1.6 times higher than samples obtained from heparinized tubes. No enzyme activity was detected with the analysis of classical galactosemia patients' samples by LC-MS/MS. Enzyme activitiy results reported as
Benzer Tezler
- Sağlıklı bebeklerde galaktoz-1-fosfat üridil transferaz aktivitesinin kantitatif analizi ve referans aralık tayini
To determine the galactose-1-phosphate uridyl transferase(GALT)activity in erythrocytes of healthy babies and to observe the reference interval
GÜNEŞ AK BAŞOL
- Over kanseri etiyopatogenezinde galaktoz-1-fosfoüridil transferaz enzim eksikliğinin araştırılması
The Investigation of the deficiency of galactose-1-phosphouridyl transferase enzyme in the ethiopathogenesis of ovarian cancer
ALPER MUMCU
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
1997
Kadın Hastalıkları ve DoğumDokuz Eylül ÜniversitesiKadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. TURHAN USLU
- Galaktozemi tanısı ve tedavisinin izlenmesine yönelik biyosensör temelli yöntemler geliştirilmesi
Development of biosensor-based methods for monitoring galactosemia diagnosis and treatment
ERHAN CANBAY
- Çocuk polikliniğimizce izlenen alt solunum yolu enfeksiyonlarında atipik pnömoni etkenlerinin yeri
Causes of atypical pneumonia in children followed in our pediatric outpatient clinic
YAVUZ KAAN BÜTÜN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2002
Çocuk Sağlığı ve HastalıklarıDokuz Eylül ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF.DR. ÖZDEN ANAL
- Sağlıklı ve orak hücre anemili kişilerde eritrosit piruvat kinaz enziminin kinetik açıdan karşılaştırılması
The Comparison of kinetic parameters of erythrocyte pyruvate kinase in sickle cell anemia cases against the normal
M. BÜLENT KAYA