Application of high performance liquid chromatography to the purification of restriction enzymes
Yüksek performanslı likit kromotografinin restiksiyon enzim saflaştırmasına uygulanması
- Tez No: 65098
- Danışmanlar: DOÇ. DR. KUTLU ÜLGEN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1997
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Boğaziçi Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 187
Özet
ÖZET Restriksiyon enzimlerinin saflaştırılmasına ilişkin teknolojilerin geliştirilmesi ve iyileştirilmesi konularına, gen mühendisliği alanına ışık tutmak açısından, büyük önem verilmektedir. TaqI restriksiyon enzimi, sıcaklık değişimlerine dayanıklı Thermus Aquaticus hücrelerinden elde edilmekte ve daha çok moleküler alanda kullanılmaktadır. Bu çalışmada, önce BSA saflaştırılması düşük ve yüksek basınçlı kromatografi kolonlarında incelenmiş, daha sonra TaqI saflaştırılması işlemi, yüksek basınçlı likit kromatografilerde, tekli ve ikili kolon sistemlerinde gerçekleştirilmiştir, iyon değiştirici kromatografi olarak, Waters 650 E geliştirilmiş protein saflaştırma sistemi kullanılmış ve ayırma işlemi 280 nm dalga boyunda, Waters 484 Tunable Wavelength detektörüyle takip edilmiştir. Restriksiyon enzimi TaqI, gradyen kazanım metodu ile, 0.1-1 M NaCl içeren tampon (pH 7.4) çözeltinin kolondan geçirildiği bir ortamda geri kazanılmıştır. Aktivite agaroz jel elektroforezi ile, saflık ise SDS-PAGE metoduyla ölçülmüştür. Düşük basınçlı kolonlarda gerçekleştirilen ön çalışmada, kolon performansı; çalışma koşullan (uzunluk, çap, sıcaklık, besleme çözeltisi konsantrasyonu, pH gibi parametreler cinsinden), BSA proteininin DE52 iyon değiştirici üzerinde adsorplanması ortamında incelenmiştir. TaqI endonükleaz enziminin HPLC uygulanmasında ise, kolon çeşitlerinin etkileri, gradyen ve izokratik kazanımlar, hücrelerin büyüme ortamı, kolona besleme miktarı gibi parametrelerin TaqI saflaştırılmasına etkileri incelenmiştir. Test edilen kolonlar arasında, semi-preparatif DEAE anyon kolonu adsorpsiyon ve desorpsiyon kademelerinde iyi bir performans göstermiştir. Gradyen geri kazanımın, gereksiz seyreltme ve uzun ayırma işlemini en aza indirgediği için, izokratik yönteme kıyasla tercih edilebileceği görülmüştür. TYE-Castenholz içinde büyüyen hücrelerden elde edilen TaqI spesifik aktivitesinin, 1.65 kez TYE-NaCl ortamında elde edilenden daha fazla olduğu saptanmıştır. DEAE anyon kolon yükleme kapasitesi, 30 + 2 mg olarak saptanmıştır. 2 gram Thermus Aquaticus hücresinden, iki anyon kolonlu saflaştırma sisteminde, yüzde 42 oranında aktif enzim kazanımı sağlanmıştır.
Özet (Çeviri)
IV ABSTRACT Great attention has been paid to the development and improvement of technologies related to restriction endonuclease downstream processing for the exploitation of genetic engineering. The restriction enzyme TaqI was produced by the thermostable bacterium Thermus aquaticus and used extensively in molecular diagnostics. In the present study, purification of BSA was carried out both by low pressure and high pressure liquid chromatography, while purification of TaqI was carried out by high pressure liquid chromatography using single and double column systems. Ion exchange chromatography was performed on Waters 650E Advanced Protein Purification System. The separation of proteins at 280 nm were monitored with Waters 484 Tunable Wavelength Detector. Gradient elution was used to recover the restriction enzyme TaqI where 0.1-1 M NaCl dissolved in extract buffer, pH 7.4 was passed through the column. The activity and the purity of the enzyme were determined by agarose gel electrophoresis and SDS-PAGE, respectively. The effects of column types, gradient and. isocratic elution, growth media and sample load on the purification of TaqI were investigated. Among the columns tested, the semi-preparative Protein-PAK DEAE weak anion exchange column resulted in good adsorption and elution. For the recovery of TaqI, gradient elution was more preferable when compared to isocratic, because gradient elution required shorter elution times that prevented unnecessary dilution and long separation times. The specific activity of TaqI in TYE-Castenholz medium was determined to be 1.65 times higher than that found in TYE- NaCl medium. The sample loading limit of the anion exchange column was determined to as 30 + 2. Two -step purification system with anion columns yielded 42 percent active enzyme recovery from 2 gram T. aquaticus cells which were grown in TYE-Castenholz medium.
Benzer Tezler
- Development and structural determination of antiangiogenic recombinant antibody structures for cancer treatment
Kanser tedavisine yönelik antianjiogenik rekombinant antikor yapılarının geliştirilmesi ve yapısal tayini
MELİS DENİZCİ ÖNCÜ
Doktora
İngilizce
2022
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
DR. AYLİN ÖZDEMİR BAHADIR
- H2 reseptör antagonistlerinin yeşil HPLC ayırımı için kemometrik optimizasyon yaklaşımı ve famotidin içeren farmasötik preparatlara uygulanması
Chemometric approach for green HPLC separation of H2 receptor antagonists and application to the analysis of famotidine containing pharmaceuticals
NAZİFE EGEŞEN HALICI
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe ÜniversitesiAnalitik Kimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NURSABAH ELİF BAŞCI
- Gibberellin A4/7/9 karışımı uygulaması ve içsel bitki hormonları seviyesinin kızılçam (Pinus brutia ten.) tohum bahçesinde çiçeklenme üzerine etkileri
Effects of gibberellin A4/7/9 application and the levels of endogeneous plant hormones on flowering in the red pine (Pinus brutia ten.) seed orchard
SEZGİ ŞEREF
Yüksek Lisans
Türkçe
2003
BiyolojiAkdeniz ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. Ş. FATİH TOPCUOĞLU
- Haliç dip tarama çamuru ve maden atığının geotekstil tüp ile susuzlaştırılması ve geoteknik mühendisliği açısından değerlendirilmesi
Dewatering of Golden Horn dredged sludge and mining waste using geotextile tubes and evaluation of these in terms of geotechnical engineering
ÜMİT KARADOĞAN
Doktora
Türkçe
2021
Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesiİnşaat Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ BERRAK TEYMÜR
- Biyotiyol sensör uygulamaları hedefli çalışmalar olarak: Boranil bileşikleri sentezi
Bio-thiol sensor applications: Synthesis of Boranil compounds
SİBEL KAYA