Heterologous expression of mouse alpha klotho protein inphotosynthetic microalgae Chlamydomonas reinhardtii
Fare alfa klotho proteininin fotosentetik mikroalg Chlamydomonas reinhardtii'de heterolog ekspresyonu
- Tez No: 659924
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ UĞUR UZUNER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Karadeniz Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 76
Özet
Klotho (Kl), yaşlanmanın güçlü bir baskılayıcısı ve çok fonksiyonlu düzenleyici bir protein olarak tanımlanmaktadır. Mutant klotho aleline sahip homozigot farelerin, tipik yaşlanma fenotipleri olan ateroskleroz, ektopik kalsifikasyon ve osteoporoz karakteristiklerini gösterdikleri, aşırı Klotho proteini üreten farelerde, yaşam ömrünün %30 uzadığı ve Klotho proteininin farklı kanser türleri üzerindeki antagonistik etkisi bilimsel olarak ispatlanmıştır. Kanserli hastalarda serbest KL (secreted KL: sKL) miktarının azaldığı ve dışardan sKL takviyesinin, kanser türleri dahil olmak üzere, çoğu kronik hastalıklar üzerinde iyileştirici etkiler gösterdiği gözlenmiştir. Gelecek 5-10 yıllık süreçte çoğu kanser dahil, diyabet, Alzheimer, Parkinson, kalp yetmezliği, böbrek yetmezliği vb. hastalıklara karşı, tedavi ve koruma amaçlı sKL takviyesinin yapılması kaçınılmaz görünmektedir. Bu çalışmada, fare α-Klotho proteinini kodlayan ilgili gen, pCAMBIA1301 vektörüne klonlanmış ve ardından Agrobacterium tumefaciensis EHA105 hücrelerine aktarılmıştır. Bakteriyel ajanlar vasıtasıyla ilgili gen Agrobacterium tabanlı transformasyon yöntemi ile Chlamydomonas reinhardtii (CC-124) mikroalg konakçılarına aktarılmıştır. CC-124 hücrelerinin pozitif transformantları, üç ardışık nesil boyunca 30 µg/ml Higromisin antibiyotiği içeren TAP agar ortamlarında seçildi. Transforme edilmiş α-Klotho geninin mikroalglerdeki moleküler varlığı bu hücrelerden genomik DNA izolasyonlarının gerçekleştirilmesinin akabinde, karşılık gelen DNA bölgesinin PCR amplifikasyonu ile doğrulandı. Daha sonra, transforme mikroalg konak hücreleri tarafından fare α-Klotho proteininin hücre dışı üretimi, sıvı TAP ortamlarında indüklendi. αKlotho'nun kültür medyalarındaki varlığı, SDS-PAGE ile doğrulanmıştır. Saflaştırılmış proteinin anti-kanserojenik etkisi, iki farklı memeli kanser hatlarında MTT testleri aracılığıyla teyit edildi. Sonuç olarak, farmasötik α-Klotho proteininin ilk kez model mikroalg C. reinhardtii konaklarında rekombinant üretimi başarıyla gerçekleştirilmiştir. Bu vesileyle, düşük maliyetli αKlotho proteini üretimi için bir temel oluşturulmuştur ve bu, yakın gelecekte insan sağlığına yönelik farklı tıbbi uygulamalarda α-Klotho proteininin erişilebilirliğini büyük ölçüde kolaylaştıracaktır.
Özet (Çeviri)
Klotho (Kl) has been described as a powerful inhibitor of aging and a multifunctional regulatory protein. Klotho has been reported that homozygous mice with the mutant klotho allele show the typical aging phenotypes of atherosclerosis, ectopic calcification, pulmonary emphysema, skin atrophy and osteoporosis. It has been scientifically proven that mice that produce excess Klotho protein increase their lifespan by 30%. The antagonistic effect of Klotho protein on different types of cancer has been scientifically proven. It was observed that the amount of liberated KL (secreted KL: sKL) in blood system is significantly decreased in cancer patients and that external sKL supplementation has curative effects on most chronic diseases, including cancer types. In the next 5-10 years, many cancers, including diabetes, Alzheimer's, Parkinson's, arteriosclerosis, heart failure, high blood pressure, kidney failure, etc. It seems inevitable to supplement SKL for treatment and protection against diseases. In this study, the gene encoding mouse α-Klotho protein was cloned into the pCAMBIA1301 vector and then transferred to Agrobacterium tumefaciensis EHA105 cell lines. The mouse α-klotho gene was transferred to Chlamydomonas reinhardtii (CC-124) microalgae hosts by Agrobacterium-based transformation method. Positive transformants of CC-124 cells were selected on TAP agar media containing 30 µg/ml hygromycin antibiotics throughout three consecutive generations. Upon the isolation of genomic DNA from transformed microalgae, the molecular confirmation of transformed α-klotho gene in microalgae genome was performed by PCR amplification of the corresponding DNA region. Later, extracellular production of the mouse α-Klotho protein by transformed microalgae host cells was induced in liquid TAP medium. The successful production of α-Klotho protein in culture medium was then confirmed through the purification processes and following SDS-PAGE analysis. The functionality of the purified protein and its anti-carcinogenic effect were tested in two different cancer cell lines through MTT tests measuring the cell viability in mammalian cell lines. In conclusion, the recombinant production of the pharmaceutical α-Klotho protein was successfully carried out for the first time in model microalgae C. reinhardtii hosts extracellularly. In this way, the basis was established for the photosynthetically low-cost production of α-Klotho protein and this will definitely facilitate the accessibility of the Klotho protein for different medicinal applications for human health in near future.
Benzer Tezler
- Functional dissection of the HNRPA2B1-CBX3 ubiquitous chromatin opening element (A2UCOE)
Başlık çevirisi yok
ÖMER FARUK ANAKÖK
- Sodyum kanalı(scn1a&scn1b) tipini kodlayan genlerdeki mutasyonların dravet sendromu ile ilişkisi
Mutation of sodium chanel's type(scn1a&scn1b) coding genes and it's relation to dravet syndrome
SAJJAD MAHBOUB
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyoteknolojiEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AFİG BERDELİ
- Expression, purification and preliminary functional characterization of the acidianus two-tailed virus TnpB endonucleases
Acıdıanus ikı kuyruklu vırüsü TnpB endonükleazlarının ekspresyonu, saflaştırılması ve öncül fonksıyonel karakterızasyonu
ARWA SALEH BURGEIA
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
Biyokimyaİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSE OKE
- Cc2d1a Heterozigot Farelerde Neurl1 ve 5Htr1a Genleri ile miR-19a-1 ve miR-19b-1 Ekspresyon Seviyelerinin İncelenmesi
Investigation of Expression Levels of miR-19a-1 and miR-19b-1 with Genes of Neurl1 and 5Htr1a in Heterozygote Mice of Cc2d1a
FATMA ŞİMŞEK
- Stage-specific binding profile of cohesin in resting and switch-activated B lymphocytes
Başlık çevirisi yok
GAMZE GÜNAL