Systematic evolution of novel 2′F-PY RNA aptamers targeting the membrane protein l-arginine/agmatine antiporter purified in mild detergent
Hafif deterjanda saflaştirilmiş l-arjinin/agmatin antiport membran proteinini hedefleyen yeni 2′f-PY RNA aptamerlerinin sistematik evrimi
- Tez No: 662053
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ÇAĞDAŞ DEVRİM SON, DR. MÜSLÜM İLGÜ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 282
Özet
Bakteriyel mikroorganizmalar, dış ortamlarındaki potansiyel olarak zararlı asidik koşulların üstesinden gelebilmek için çok sayıda ve çeşitli sistemler geliştirmiştir. Özellikle, bazı patojenik ve diğer patojenik olmayan enterik bakteriler, hücre içi asidifikasyona ve memeli midesinin aşırı asidik koşulları altında hayatta kalmayı mümkün kılan hasara karşı koyabilmek için birlikte çalışan bir dizi istisnai ve iyi organize edilmiş asit direnci (AR) mekanizmasına sahiptir. Hem virülan hem de iyi huylu suşları ile ortak Escherichia coli, nötr pH'a adaptasyonu göz önüne alındığında özellikle dikkat çekicidir. Bu bakterilerde, düşük dış pH baskısı, bir sitoplazmik pirodoksal-5′-fosfat (PLP) bağımlı amino asit dekarboksilaz ve bir iç plazma membran amino asidi antiporter jenerik bileşenden oluşan oldukça güçlü proton tüketimli AR sistemleri aracılığıyla etkili bir şekilde hafifletilir. Bir substrat amino asidinin dekarboksilasyonu sonrasında bir ürüne ve CO2'ye dönüştürülmesi protona bağımlı PLP katalizli bir şekilde elde edilir. Daha sonra, dahili olarak üretilen dekarboksilasyon ürününün hem antiporter aracılı değişimi hem de harici olarak yerleştirilmiş substrat amino asidi, sistemin çalışmasını sağlar ve hücrenin pH homeostazının geri kazanılmasına yardımcı olur. Bu sistemlerden biri, AdiA ve AdiC tarafından oluşturulan arginin bağımlı asit direnci (ADAR) sistemidir: sırasıyla indüklenebilir arginin dekarboksilaz enzimi ve arginin / agmatin antiportörü. AR sistemlerinin etkileyici yeterliliği ve özellikle bulaşıcı, hastalığa neden olan enterik bakteriler tarafından kullanılanlar, büyük bir maliyete- insanların refahına ve sağlığına – sebep olmaktadır. Bundan böyle, bu çalışmada, ve ilk kez, ADAR sisteminin integral membran proteini (MP) AdiC'ye karşı beş 2'FY RNA aday aptamerini (noorA, noorB, noorC, AdiC19 ve AdiC72) seçilimini gerçekleştirdik. Kısaca, AdiC, BL21 (DE3) pLysS hücre hattında uygun prokaryotik ekspresyon sistemi kullanılarak rekombinant olarak eksprese edildi ve his-etiketli AdiC, daha sonra n-dodesil-β-D-maltopiranosid (DDM) kullanılarak çözündürme yoluyla ekstrakte edildi ve aynı deterjanda metal afinite kromatografisiyle saflaştırıldı. SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile varlığı onaylandıktan sonra, saf rekombinant AdiC, 2'F-Pirimidin ile modifiye edilmiş aday RNA aptamerlerinin in vitro seçimi için Eksponansiyel zenginleştirme (SELEX) ile 8 tur geleneksel Ligandların Sistematik Evrimine tabi tutuldu. Son olarak elde edilen seçim kütüphanesinden oligonükleotid sekansları klonlandı ve Sanger sekanslaması ile sekansları belirlendi. Üç dizi (noorA noorB ve noorC) 100 klon arasında bol miktarda bulundu ve bu nedenle sonraki bilişim analizleri için temel olarak seçildi. RNAfold ve Kinefold programları tarafından tahmin edilen birincil ve optimal (MFE) 2D ikincil yapıların karşılaştırmalı analizleri ile hesaplamalı bir yaklaşım kullanarak, üç korunmuş motifi belirleyebildik (bunlardan biri varsayılan yerel bağlanma alanı ve diğer ikisi de stabilizatör olarak açıklandı). Bu motifler noorA, B ve C'de ve farklı bir filogenetik ailede iki tane daha tanımlanmış dizide (AdiC19 ve AdiC72) belirlendi. Ayrıca, bu beş proto-aptamerin uyduğu bir konsensüs ikincil yapı tanımladık. Stabilizatör motiflerinin sonraki tahmin odaklı (in-siliko) mutasyonel delesyonları, varsayılan bağlanma motifini barındıran alt yapının korunması üzerindeki tahmini MFE yapılarının birçoğunda küresel etkilerini ortaya çıkardı. Bu çalışmada elde edilen beş aptamer adayı, hastalardaki bakteriyel enfeksiyonları değerlendirmek için (örneğin aptasensörler tarafından) veya antimikrobiyal farmasötik ilaçlar veya ilaç verme ajanları olarak kullanılabilecekleri aptamer bazlı teşhis ve tedavi alanlarında uygulama için çok yönlü ajanlar olarak kullanılma potansiyeline sahiptir. Temel bilimsel araştırma düzeyinde, bu aptamerler, AdiC'nin yapısal özelliklerini ve biyokimyasal işlevlerini daha iyi anlamak için de yararlı olabilir. Daha genel olarak, son 20 yılda saflaştırılmış tam uzunluktaki proteinlere karşı SELEX denemelerinin azlığı göz önüne alındığında, bu tez kendini, saflaştırılmış tam uzunluktaki aptamerlerin kullanılabilirliğine dikkat çeken ilk çalışmalardan biri olarak sunulmaktadır. Bu yöntem, geleneksel protein-SELEX'in hücre-SELEX'e göre sağladığı avantajlarla ve çözülebilir hücre içi ve hücre dışı MP alanlarının hedef olarak kullanımıyla uyumludur. Bu tezin sonunda, çok geçişli veya derin entegrasyon ve membranlar içindeki yakınlık nedeniyle aptamer hedeflemesi için genellikle erişilemeyen reseptörler, taşıyıcılar ve kanallar gibi karmaşık MP'ler için mevcut özel bir fırsat sunmaktadır.
Özet (Çeviri)
Bacterial microorganisms have developed numerous and diverse systems to handle potentially detrimental acidic conditions in their external environment. In particular, some pathogenic and other nonpathogenic enteric bacteria have a number of exceptional and well-organized acid resistance (AR) mechanisms that work together to counter intracellular acidification and damage and enable survival under the extreme acidic conditions of the mammalian stomach. The common Escherichia coli with both its virulent and benign strains is particularly remarkable considering its adaptation to neutral pH. In these bacteria, the challenge of a low external pH is efficiently mitigated by highly potent proton consumption AR systems that consist of two generic components: a cytoplasmic pyrodoxal-5′-phoshpate (PLP)-dependent amino acid decarboxylase and an inner plasma membrane amino acid antiporter. Both, decarboxylation of a substrate amino acid into a product and CO2 in a proton-dependent PLP-catalyzed manner and antiporter-mediated exchange of the internally generated decarboxylation products with the externally located substrate amino acid maintain the system running and aid in restoring pH homeostasis of the cell. One of these systems is the arginine-dependent acid resistance (ADAR) system constituted by acid-induced arginine decarboxylase (AdiA) and arginine-agmatine antiporter (AdiC). The impressive competence of AR systems and especially those used by infectious, disease-causing enteric bacteria, comes at a big cost—the well-being and health of humans. Henceforth, in this work, for the first time, we raised five candidate 2′FY RNA candidate aptamers (noorA, noorB, noorC, AdiC19 and AdiC72) against the ADAR system's integral membrane protein (MP), AdiC. Briefly, AdiC with a 10× Histidine tag on the C-terminal was recombinantly overexpressed using the convenient prokaryotic expression system in BL21(DE3) pLysS cell line and was extracted by solubilizing using n-dodecyl-β-D-maltopyranoside (DDM) and purified by metal affinity chromatography in the same detergent. After confirming the purity by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis), recombinant AdiC was subjected to 8 rounds of conventional Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) for the in vitro selection of 2′F-Pyrimidine-modified candidate RNA aptamers. Oligonucleotide sequences from the final library of selection were cloned and identified by Sanger sequencing. Three sequences (noorA noorB and noorC) were found abundant among 100 clones and thus chosen as the basis for subsequent informatics analyses. Using a computational approach with comparative analyses of primary and optimal (MFE) 2D secondary structures predicted by RNAfold and Kinefold programs, we were able to identify three conserved motifs (one of which we annotated as a putative local binding domain and the other two as stabilizers) in noorA, B and C and also in two more sequences (AdiC19 and AdiC72) identified in a different phylogenetic family. We also defined a consensus secondary structure to which these five proto-aptamer conform. Subsequent prediction-driven (in-silico) mutational deletions of the stabilizer motifs revealed a global impact on several of the predicted MFE structures in maintaining the substructure that harbors the putative binding motif. The five aptamer candidates generated in this work may have prospects as versatile agents applied in areas of aptamer-based diagnostics and therapeutics where they may be used to assess bacterial infections in patients (e.g. by aptasensors) or as antimicrobial pharmaceutical drugs or drug delivery agents for these infections. At the level of basic scientific research, these aptamers may also be useful in further understanding the structural features and biochemical functions of AdiC. More broadly, given the scarcity of SELEX trials against purified full-length MPs over the past ∼20 years, this thesis presents itself as one of the proof-of-principle studies that bring attention to the usability of purified full-length MPs for the selection of aptamers after MP reconstitution in detergent micelles. This advocacy is in line with the advantages provided by conventional protein-SELEX over cell-SELEX and utility of soluble intra- and extracellular MP domains used as targets. At the end of this thesis, we direct the spotlight on a special opportunity available for complex MPs such as receptors, transporters, and channels that may often be inaccessible for aptamer targeting due to multi-passing or deep integration to and intimacy with their membranes.
Benzer Tezler
- Epileptik preiktal aktivitelerin EEG-Aura tabanlı evrişimsel sinir ağları ve topoğrafik haritalama yaklaşımı ile değerlendirilmesi
Evaluation of epileptic preictal activities by EEG-Aura based convolutional neural networks and topographic mapping approach
HASAN POLAT
Doktora
Türkçe
2020
Elektrik ve Elektronik MühendisliğiDicle ÜniversitesiElektrik-Elektronik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET SİRAÇ ÖZERDEM
- Dinamik manyetik rezonans görüntüleme ve ultrason kontrast ajanlı power doppler ultrasonografi ile meme lezyonlarında benign ve malign ayrımı
Başlık çevirisi yok
FAİK SUNGURLU
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2002
OnkolojiMarmara ÜniversitesiRadyodiagnostik Ana Bilim Dalı
DOÇ.DR. ERKİN ARIBAL
- Taksol'e bağlı olarak oluşan radyoduyarlılığın moleküler mekanizmasının araştırılması
Studies on the molecular mechanisms of Taxol-induced radiosensitization
BELMA KURDOĞLU
Doktora
Türkçe
1998
Onkolojiİstanbul ÜniversitesiTemel Onkoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİN DARENDELİLER
- Sinan dönemi camilerinin kubbe ve alt destek sistemlerinin dijital stereotomi yaklaşımıyla yeniden ele alınması
Revisiting the dome and lower support systems of the Sinan period mosques with digital stereotomy approach
NECMETTİN SANCAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2021
Mimarlıkİstanbul Teknik ÜniversitesiBilişim Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SEMA ALAÇAM
- Effects of disorder in iron-based superconductors
Başlık çevirisi yok
SULTAN DEMİRDİŞ
Doktora
İngilizce
2012
Fizik ve Fizik MühendisliğiEcole PolytechniqueDR. CORNELIS JACOMINUS VAN DER BEEK