Meme kanseri hücre hattı AU-565'e karşı hibridoma teknolojisine dayalı poliklonal antikorların üretilmesi
Production of polyclonal antibodies based on hybridoma technology against breast cancer cell line AU-565
- Tez No: 684364
- Danışmanlar: DOÇ. DR. EMRAH ŞEFİK ABAMOR
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyomühendislik, Biyoteknoloji, Onkoloji, Bioengineering, Biotechnology, Oncology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyomühendislik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 124
Özet
Kanser kardiyovasküler hastalıklardan sonra dünyada en çok görülen ikinci hastalıktır. Uluslararası Kanser Araştırma Merkezi ve Dünya Sağlık Örgütü'nün son verilerine göre, 2018 yılında 18,1 milyon yeni kanser vakası meydana gelmiştir. Meme kanseri ise dünyada kadınlar arasında en sık görülen kanser türüdür. Meydana gelen kanserlerin yaklaşık 2 milyonunu meme kanseri oluşturmaktadır. Meme kanseri tedavisinde cerrahi, kemoterapi, hormonoterapi ve radyoterapi gibi tedavi yöntemleri kullanılmaktadır. Cerrahi müdahale kanserin erken evrelerinde olumlu sonuçlar verse de sonraki evrelerde metastaz yapıldığı için kanser birçok noktaya yayıldığından olumlu sonuçlar vermemektedir. Radyoterapide ise kanser hücreleri X-ışınlarına direnç gösterebildiğinden dolayı metastazlara yol açmaktadır. Kemoterapi ise kanser tedavilerinde en etkili metot olmakla birlikte kanser ilaçlarının hem normal hücrelere hem de kanser hücrelerine zarar vermesinden dolayı vücutta olumsuz etkilere neden olmaktadır. Hormonoterapi ise hormon reseptörleri pozitif olan meme kanseri türlerinde yüksek oranda etkinlik göstermektedir. Fakat diğer meme kanseri çeşitlerinde etkinlikleri düşüktür. Bu tedavi yöntemlerinin yetersizliğinden dolayı antikor tedavileri günümüzde önem kazanmıştır. Genel olarak antikor tedavilerinde monoklonal antikorlar kullanılmasına rağmen monoklonal antikorların tanı ve tedavide yüksek spesifiteye sahip olmalarına rağmen bu spesifite tek epitop bölgesine bağlanabildikleri için poliklonal antikorlar ile karşılaştırıldıklarında düşük avidite sonuçlarıyla karşılaşılmaktadır. Bundan dolayı poliklonal antikor tedavilerine önem verilmesi gerekmektedir. Literatürde meme kanserine karşı hibridoma teknolojisine dayalı çalışmalarda meme kanseri hücrelerinden farklı antijen hazırlama metotları ile antijen hazırlanmasına yönelik (sonikasyon, dondurma-çözme, otoklavlama) çalışmalar bulunsa da hazırlanan bu antijenlerin farklı adjuvanlar ile formülasyonlarının oluşturduğu immün yanıtların karşılaştırılmasına ve elde edilen antikorların meme kanseri hücreleri üzerinde etkinkliklerinin incelenmesine yönelik bir çalışmaya rastlamadık. Bu tez çalışmasında meme kanserinin tanı ve tedavisinde kullanılmak üzere AU-565 meme kanseri hücre hattından çeşitli metotlar kullanılarak antijenlerin elde edilmesi, bu antijenlerin farklı adjuvanlar ile kombinasyonları hazırlanarak hibridoma teknolojisine dayalı poliklonal antikorların üretilmesi ve geliştirilen antikorların konvansiyonel kemoterapötik ilaçlar ile meme kanseri hücrelerindeki in vitro antikanser aktivitelerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda poliklonal antikorların üretilebilmesi için, AU-565 meme kanseri hücre hattının kültürü devam ettirilerek bu hücrelerden sonikasyon, dondurma-çözdürme ve otoklavlama yöntemleri ile tüm meme kanseri hücre antijenleri elde edildi. Hazırlanan bu antijenler ile Polioksidonyum ve Freund's adjuvanları kombine edilerek BALB/c türü fareler immünize edildi. Farelerin immünizasyonunun ardından farelerden alınan kan serumlarının ELISA yöntemi ile antikor tayinleri yapıldı. En yüksek antikor yanıtı alınan farelerin dalakları alınarak B hücreleri izole edildi. İzole edilen B hücreleri AG-8 myeloma hücreleri ile kimyasal füzyona uğratılarak antikor üreten hibridoma hücreleri elde edildi. Bu hücrelerin ürettikleri antikor seviyeleri ELISA metodu kullanılarak analiz edildi. Elde edilen antikorlar tek başına ve ilaçlar ile kombine edilerek meme kanseri hücreleri üzerinde uygulandı ve antikanser aktiviteleri incelendi. Elde edilen sonuçlar çerçevesinde, sonikasyon metodu ile üretilen antijen miktarının, dondurma-çözdürme metodu ile üretilen antijen miktarından 2 kat, otoklavlama metodu ile elde edilen antijen miktarından ise 4,5 kat daha fazla olduğu belirlenmiştir. Aynı zamanda sonikasyon ile elde edilen antijenlerin deney hayvanları için en ideal konsantrasyonunun 40 µg/ml olduğu makrofaj hücre kültürü sisteminde nitrik oksit seviyelerine bakılarak belirlenmiştir. Nitrik oksit analizinde aynı zamanda antijenlerin tek başlarına makrofajları yeterince aktive edemedikleri, Freund's ya da Polioksidonyum adjuvanıyla birarada uygulandıklarında makrofajların ürettikleri nitrik oksit miktarlarının kayda değer bir biçimde arttığı tespit edilmiştir. Bu sonuçlar ışığında elde edilen antijenlerin adjuvanlarla kombine halde deney hayvanlarına tatbik edilmesine karar verilmiştir. Hazırlanan formülasyonların farelere uygulanmasından sonra 12. haftanın sonunda en yüksek antikor yanıtı sonikasyon antijeni ve Freund's adjuvanı kullanılarak hazırlanan aşı formülasyonu ile immünize edilen farelerde alınmıştır. Freund's adjuvanı ile immünize edilmiş farelerde 12.immünizasyon sonrasında, antikor düzeyinin kontrole göre yaklaşık 10 kat arttığı saptanmıştır. Polioksidonyum adjuvanı ile immünize edilmiş farelerde ise 12.immünizasyon sonucunda antikor düzeyinin kontrole göre yaklaşık 1.25 kat arttığı saptanmıştır. Sonraki aşama olan füzyon sonucu oluşan hibridomaların seçici besiyeri içerisinde kültürü yapılmış ve ürettikleri poliklonal antikor yanıtları ELISA yöntemi ile tespit edilmiştir. Bu antikor yanıtlarına göre hibridoma kültürünün 7. günden itibaren antikor yanıtı alınmış ve 55. güne kadar antikor yanıtları devam etmiştir. Bu işlemlerin ardından hibridoma hücreleri tarafından AU-565 hücre hattına karşı geliştirilen antikorların MCF-7 ve AU-565 meme kanseri hücre hatlarına karşı reaktiviteleri incelenmiştir. AU-565 meme kanseri hücre hattına karşı geliştirilen poliklonal antikorların AU-565 hücrelerine karşı, verilen antikor miktarına bağlı olarak etkilerinin yüksek olduğu ve %50 oranında AU-565 hücrelerini öldürdüğü gözlenmiştir. Aynı zamanda AU-565 meme kanseri hücre hattına karşı geliştirilen poliklonal antikorların MCF-7 hücrelerine de karşı etkinliklerinin yüksek olduğu ve %35 oranında MCF-7 hücrelerini öldürdüğü belirlenmiştir. Bu çalışmayı takiben AU-565 meme kanseri hücre hattına karşı geliştirilen poliklonal antikorların günümüzde kullanılan kanser ilaçları ile oluşturulan kombinasyonlarının MCF-7 ve AU-565 meme kanseri hücre hatlarındaki inhibitör aktiviteleri de araştırılmıştır. AU-565 meme kanseri hücre hattında en yüksek etkinliği %82 öldürme oranı ile poliklonal antikorlarla kombine edilen 200 µg konsantrasyonda methotrexate ilacı, MCF-7 meme kanseri hücre hattında ise en yüksek etkinliği %82 öldürme oranı ile poliklonal antikorlarla kombine edilen 200 µg konsantrasyonda tamoksifenialcı göstermiştir. Bu tez çalışmasının son aşamasında ise elde edilen poliklonal antikorların meme kanserinin tanısında kullanılma potansiyelleri incelenmiştir. AU-565 meme kanseri hücre hattına karşı geliştirilen antikorlar beklendiği üzere en yüksek etkileşimi sonikasyon metodu ile bu hücre hattından elde edilen antijenlere karşı göstermiştir. Günümüzde tedavide kullanılan antikorlardan biri olan Herceptin de en fazla etkileşimi sonikasyon metodu ile üretilen antijen ile göstermiştir. Fakat tez çalışması kapsamında üretilen poliklonal antikorlara göre etkileşimleri düşüktür. Bunun nedeni Herceptinin HER2'ye karşı üretilen monoklonal bir antikor olmasıdır. Oluşturulan antijenler ise birden fazla protein içermektedir. Bundan dolayı poliklonal antikorlar daha fazla antijen ile etkileşim göstermektedir. MCF-7 hücre hattından üretilen antijenler ile de bu deney tekrarlanmıştır. AU-565 meme kanseri hücre hattına karşı geliştirilen antikorlar en yüksek absorbans verimini sonikasyon metodu ile elde edilen antijenlere karşı göstermiştir. Günümüzde kullanılan antikorlardan olan herceptinin kullanılan antijenler ile etkileşimleri yok denecek kadar azdır. Bunun nedeni MCF-7 hücre hattının HER2 negatif olmasıdır. Herceptin ise HER2'ye karşı üretilen monoklonal antikor olduğundan MCF-7 hücre hattından üretilen antijenlere karşı etkileşim gösterememiştir. Bu bilgiler ışığında AU-565 hücre hattına karşı geliştirilen poliklonal antikorların MCF-7 hücre hattı antijenleri ile de reaksiyona girebildiği söylenebilir. Bu çalışmalar doğrultusunda, AU-565 hücre hattına karşı geliştirilen poliklonal antikorların etkinliğinin sadece AU-565 hücre hattı ile sınırlı olmadığı ve diğer meme kanseri hücre hatları için de kullanılabileceği belirlenmiştir. Böylece bu çalışma kapsamında ilk kez AU-565 hücre hattına karşı sonikasyon yöntemi kullanılarak elde edilen antijenlerin Freund's ve Polioksidonyum adjuvanları ile deney hayvanlarına tatbiki sonrasında hibridoma teknolojisine dayalı poliklonal antikor üretimi gerçekleştirilmiştir. Elde edilen veriler ışığında üretilen antikorların meme kanserinin tanısında ve tedavisinde yüksek verimle kullanılma potansiyelleri olduğu ortaya çıkmıştır.
Özet (Çeviri)
Cancer is the second most common disease in the world after cardiovascular diseases. According to the latest data of the International Cancer Research Center and the World Health Organization, 18.1 million new cancer cases are identified in 2018. Breast cancer is the most common type of cancer among women in the world. Besides, breast cancer is the most frequent cancer type detected among women. Treatment methods such as surgery, chemotherapy, hormonotherapy and radiotherapy are used in the treatment of breast cancer. Although surgical intervention gives positive results in the early stages of cancer, it does not give positive results since metastasis occurs in the later stages. Cancer cells cause metastases because they can resist X-rays through radiotherapy applied. On the other hand, chemotherapy is the most effective method in cancer treatments, but it leads to adverse effects in the body as cancer drugs damage both normal cells and cancer cells. Hormonotherapy is highly effective in breast cancer types with positive hormone receptors. However, their effectiveness is low in other breast cancer types. Nowadays, antibody treatments have gained importance today due to the inadequacy of these treatment methods. In general, although monoclonal antibodies have high specificity in diagnosis and treatment in antibody treatments, they result in low avidity when compared with polyclonal antibodies because they can specifically bind to a single epitope region. Therefore, attention should be paid to polyclonal antibody treatments. Although there are studies in the literature on antigen preparation from breast cancer cells with different antigen preparation methods (sonication, freezing-thawing, autoclaving) in studies based on hybridoma technology against breast cancer, there is no study about the comparison of the immune responses of these prepared antigens with different adjuvants and their formulations and to compare the effects of the obtained antibodies on breast cancer cells. In this thesis study, it was aimed to prepare antigens from AU-565 breast cancer cell line using different antigen preparation methods and to develop their combinations with different adjuvants to produce polyclonal antibodies based on hybridoma technology to be used in the diagnosis and treatment of breast cancer, and to use the antibodies created in breast cancer cells for therapeutic purposes by testing them with drugs. For this purpose, AU-565 breast cancer cell line was cultured and antigen was prepared from these cells using sonication, freeze-thaw and, autoclaving methods, in order to produce polyclonal antibodies. BALB/c strain mice were immunized by combining the prepared antigens with Polyoxidonium and Freund's adjuvants. After immunization of the mice, antibody determinations were made by ELISA method of blood sera taken from mice. B cells were isolated from the spleens of mice with the highest antibody response. Antibody-producing hybridoma cells were obtained by chemical fusion of isolated B cells with AG-8 myeloma cells. Antibody production of these cells was carried out using the ELISA method. The antibodies obtained alone or in combination with drugs were tested in breast cancer cells and their activities were evaluated. In the light of the results obtained, it was determined that the amount of antigen obtained by the sonication method was 2 times more than the amount of antigen produced by the freezing-thawing method and 4.5 times more than the amount of antigen obtained by the autoclaving method. At the same time, the ideal concentration of antigens obtained by sonication for experimental animals was determined by looking at nitric oxide levels in the macrophage cell culture system, which was 160 µg/ml. However, the use of antigens alone was found to be ineffective and their combination with Freund's adjuvant or Polyoxidonium adjuvant should be used. After the administration of the formulations to mice, at the end of the 12th week, the highest antibody response was obtained in mice immunized with the vaccine formulation prepared using sonication antigen and Freund's adjuvant. After the 12th immunization in mice immunized with Freund's adjuvant, it was determined that the antibody level increased approximately 10 times compared to the control. In mice immunized with Polyoxidonium adjuvant, it was determined that the antibody level increased approximately 1.25 times compared to the control as a result of the 12th immunization. In the next stage, hybridomas generated by fusion were cultured in a selective medium and their polyclonal antibody responses were determined by the ELISA method. According to these antibody responses, the antibody response was obtained from the 7th day of the hybridoma culture and antibody responses continued until the 55th day. The activities of antibodies against the AU-565 cell line by hybridoma cells against MCF-7 and AU-565 breast cancer cell lines were investigated. It has been observed that polyclonal antibodies against AU-565 breast cancer cell lines have high effects against AU-565 cells, depending on the amount of antibody administered, and kill 50% of AU-565 cells. It was observed that polyclonal antibodies generated against the AU-565 breast cancer cell line were highly effective and killed 35% of MCF-7 cells, depending on the amount of antibody administered against MCF-7 cells. At the same time, the killing effects of polyclonal antibodies generated against the AU-565 breast cancer cell line on MCF-7 and AU-565 breast cancer cell lines were also examined. In the AU-565 breast cancer cell line, the highest killing rate was 82%, while the polyclonal antibody combined with methotrexate drug at 200µg concentration, while in the MCF-7 breast cancer cell line, the highest killing rate was 82% and, the polyclonal drug combined with tamoxifen drug at 200 µg concentration. is antibody. The usability of the obtained polyclonal antibodies in the diagnosis of breast cancer was examined. Since antibodies generated against the AU-565 breast cancer cell line were produced from mouse-derived hybridoma by sonication method, the highest absorbance efficiency was shown to interact with the sonication method antigen obtained from the AU-565 cell line. Among the antibodies used today, Herceptin showed the greatest interaction with the antigen produced by the sonication method. However, their interactions are low compared to polyclonal antibodies. This is because Herceptin is a monoclonal antibody produced against HER2. The generated antigens contain more than one protein. Therefore, polyclonal antibodies interact with more antigens. This experiment was also repeated with antigens produced from the MCF-7 cell line. Antibodies raised against the AU-565 breast cancer cell line showed the highest absorbance efficiency with sonication method antigen. Among the antibodies used today, the interactions of Herceptin are negligible. This is because the MCF-7 cell line is HER2 negative. Since Herceptin is a monoclonal antibody produced against HER2, it could not interact with antigens produced from the MCF-7 cell line. In the light of this information, polyclonal antibodies against the AU-565 cell line also interacted with the MCF-7 cell line. In the light of these studies, it was determined that the efficacy of polyclonal antibodies against the AU-565 cell line is not limited to the AU-565 cell line and can also be used for other breast cancer cell lines. Thus, within the scope of this study, for the first time, polyclonal antibody production based on hybridoma technology was carried out using Freund's and Polyoxidonium adjuvants combined with antigens produced by antigen preparation method by sonication against AU-565 cell line.
Benzer Tezler
- Polikaprolakton temelli nanopartiküler taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi, karakterizasyonu ve meme kanseri kök hücrelerine karşı etkinliğinin in vitro incelenmesi
Development characterization of polycaprolactone based nanoparticular carrier systems and in vitro investigation of their efficacy on breat cancer stem cells
SAHAR DINPARVAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
BiyomühendislikYıldız Teknik ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ADİL M. ALLAHVERDİYEV
- Nitril fonksiyonellenmiş N-heterosiklik karben öncülleri ve karben kompleksleri sentezi: Enzim inhibisyon, antikanser aktivite ve DNA bağlanma özellikleri
Nitrile functionalized N-heterocyclic carbene precursors and carbene complex synthesis: Enzyme inhibition, anti-cancer activity and dna binding properties
ERKAN ÖNER
Doktora
Türkçe
2022
BiyokimyaMersin ÜniversitesiEczacılık Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SERAP YALIN
PROF. DR. YETKİN GÖK
- Kanser tedavisinde gen susturulması için hyalüronik asit-polietilenimin taşıyıcı sisteminin geliştirilmesi
Development of hyaluronic acid-polyethyleneimine delivery system for gene silencing in cancer treatment
BESTE ÇAĞDAŞ TUNALI
Doktora
Türkçe
2019
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
PROF. DR. MUSTAFA TÜRK
- Mitokondriyal hedefli farklı nano iskelet yapılarındaki yeni floresans kaliks[4]aren-isatin bileşiklerinin sentezi ve antiproliferatif özelliklerinin incelenmesi
Synthesis and investigation of antiproliferative properties of new fluorescence calix[4]arene-isatin compounds in different nano-skeletal structures with mitochondrial target
ALEV OĞUZ
- Meme kanseri hücre hattı MDA-MB-231 üzerine Cladonia furcata'nın koruyucu etkisinin belirlenmesi
Protective effects of Cladonia furcata on MDA-MB-231 breast cancer cell line
ELİF AKBULUT
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyolojiYozgat Bozok ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSTAFA KOCAKAYA