Investigation of the role of neurotrophin receptor associated death domain protein in regulation of Wnt/β-catenin signaling using the embryonic and CRISPR/Cas9 knockout models of zebrafish
Nörotrofin reseptörü ile ilişkili ölüm bölgesi proteininin Wnt/ β - katenın sinyal iletiminin düzenlenmesindeki rolünün zebrabalığı embriyonik modeli ve CRISPR/Cas9 knockout modeli ile araştırılması
- Tez No: 685399
- Danışmanlar: DOÇ. DR. HATİCE GÜNEŞ ÖZHAN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
- Enstitü: İzmir Uluslararası Biyotıp ve Genom Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 77
Özet
Wnt/ β-katenin sinyal yolu, gelişim ve yetişkinlik döneminde hücre proliferasyonu, göçü, farklılaşması ve apoptoz gibi birçok biyolojik süreçte önemli roller oynar. Yıllar boyunca araştırmacılar tarafından yolun birçok düzenleyici molekülü ortaya çıkarılmasına rağmen tüm mekanizma hala kayıp parçaları olan ve çözülmeyi bekleyen bir yapboz gibidir. Bu çalışmada, bir p75NTR homoloğu olan nörotrofin reseptörü ile ilişkili ölüm bölgesi (nradd) geninin, zebra balığı embriyolarında Wnt /β-kateninkatenin sinyal yolağının negatif bir geri bildirim düzenleyicisi olduğunu belirledik. Zebra balığı embriyolarında nradd'ın aşırı ifade edilmesinin gastrulasyon sırasında Wnt8 aracılı /-katenin sinyal iletimi tarafından kontrol edilen ventrolateral mezoderm hücre kaderlerini ve nöroektodermal hücre kaderlerini önemli ölçüde baskıladığını ortaya çıkardık. Ayrıca, nradd aşırı ifadesi Lymphoid Enhancer Binding Factor 1(Lef1), Sp5 transcription factor-like (Sp5l), and conductin (Axin2) gibi Wnt hedef genlerinin ifadesini bastırıp, aşırı yüksek Wnt8 aracılı /β-katenin sinyal aktivitesi sonucu embriyolarda oluşan, ön beyin ve gözlerin kaybı gibi etkileri kurtarmıştır. Ek olarak, CRISPR/Cas9 gen düzenleme sistemi ile oluşturulan nradd F0 fonksiyon kaybı modelini araştırdık. F0 embriyolarında nradd fonksiyon kaybını verimli bir şekilde gözlemlemek için, tek hücreli embriyolara nradd genini hedefleyen 4 kılavuz RNA içeren Cas9 proteinini enjekte ettik. Yaklaşımımız, F0 crispantlarda nradd ifadesini önemli ölçüde bastırmıştır. Crispantlarda, Wnt-hedef genlerin ifadeleri, önemli ölçüde artması, Wnt /β-katenin sinyallemesinde Nradd'ın negatif düzenleyici rolünü desteklemiştir. Ayrıca, önceki çalışmalarda Nradd'ın tanımlanmış apoptotik işlevini değerlendirmek için crispantlarda apoptoz seviyesi de analiz ettik. İlginç bir şekilde 24 saatlik crispant embriyolarda, pro-apoptotik genlerin artan ekspresyon seviyesi ve bölünmüş kaspaz-3 antikorunun artan immünoreaktivitesi ile teyit edilen artan bir apoptoz seviyesi gözlemledik. Özetle, Nradd'ın Wnt /β-katenin sinyal yolağının negatif bir geri bildirim düzenleyicisi olduğunu ve embriyonik gelişim sırasında hücre ölümünün bir düzenleyicisi olarak hareket ettiğini ortay çıkardık. Yolak düzenleyicileri, özellikle kanser için hedeflenen tedavilerde ilaç hedefleri olarak hizmet ettiğinden, moleküler düzeyde Nradd'ın daha fazla karakterizasyonu, hem henüz bilinmeyen yolak mekanizmalarının aydınlatılmasına hem de yolu hedefleyen yeni ilaçların keşfedilmesine önemli ölçüde katkıda bulunacaktır.
Özet (Çeviri)
Wnt/β-catenin signaling pathway plays essential roles in many biological processes including cell proliferation, migration, differentiation and apoptosis during development and adulthood. Many regulatory molecules of the pathway were revealed by researchers over the years. Yet, the whole mechanism is a puzzle with missing pieces, waiting to be solved. In this study, we identified neurotrophin receptor-associated death domain (nradd), a homolog of p75 neurotrophin receptor (p75NTR), as a negative feedback regulator of Wnt/β-catenin signaling in zebrafish embryos. We revealed that nradd overexpression significantly suppresses Wnt8-mediated/β-catenin signaling which controls mesoderm and neuroectoderm patterning during gastrulation. Also, its overexpression suppresses the expression of Wnt-target genes: Lymphoid Enhancer Binding Factor 1(Lef1), Sp5 transcription factor-like (Sp5l), and conductin (Axin2) and can rescue the effect of high Wnt8-mediated/β-catenin signaling activity, loss of forebrain and eyes. In addition, we investigated nradd F0 knockout model generated by CRISPR/Cas9 gene-editing. To observe nradd loss-of-function efficiently in F0 embryos, we injected Cas9 protein with 4 guide RNAs targeting nradd gene to one-celled embryos. Our approach is significantly suppressed nradd expression in F0 crispants. In crispants, Wnt-target genes' expressions are significantly upregulated, supporting the negative regulator role of Nradd in Wnt/β-catenin signaling. Moreover, we also analyzed the apoptosis level in crispants to evaluate the defined apoptotic function of nradd by previous studies. Interestingly, we observed an increased apoptosis level in crispant embryos at 24 hours-post-fertilization (hpf), confirmed by increased expression level of pro-apoptotic genes and increased immunoreactivity of cleaved-caspase-3 antibody. In summary, Nradd acts as a negative feedback modifier of Wnt/β-catenin signaling and a regulator of cell death during embryonic development. As the pathway modifiers serve as attractive drug targets especially in targeted therapies for cancer, further characterization of Nradd at the molecular level will significantly contribute to both elucidations of as yet unknown pathway mechanisms and the discovery of novel drugs targeting the pathway.
Benzer Tezler
- Investigation of the role of neurotrophin receptor associated death domain protein in regulation of WNT/ß-catenin signaling using the zebrafish model
Nörotrofin reseptörü ile ilişkili ölüm bölgesi proteininin WNT/ß- katenin sinyal iletiminin düzenlenmesindeki rolünün zebra balığı modelinde araştırılması
ÖZGÜN ÖZALP
Doktora
İngilizce
2022
BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. HATİCE GÜNEŞ ÖZHAN
- Investigation of the role of p75NTR homologue nradd in formation of degeneration and regeneration responses in Alzheimer's disease in zebrafish amyloid ß42 toxicity model
Alzheimer hastalığında nöronal dejenerasyon ve rejenerasyon yanıtlarının oluşumunda p75NTR homoloğu nradd'ın rolünün zebrabalığı amiloid ß42 toksisite modelinde araştırılması
DOĞAÇ İPEKGİL
Yüksek Lisans
İngilizce
2024
BiyolojiDokuz Eylül ÜniversitesiGenom Bilimleri ve Moleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HATİCE GÜNEŞ ÖZHAN
- Bdnf'nin NLRP3 inflamazomu ve NLRP3 aracılı piroptoz üzerine etkisinin incelenmesi
Investigation of the effect of bdnf on NLRP3 inflammasome and NLRP3 mediated pyroptosis
ŞENİZ ERDEM
Doktora
Türkçe
2024
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiTıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET ALVER
- Nikotin bağımlı sıçan soylarında TCF7L2'nin nikotin bağımlılığı ve glukoz metabolizması üzerine etkileri
The effects of TCF7L2 on nicotine addiction and glucose metabolism in nicotine dependent rat breed
İBRAHİM HALİL ÇİTÇİ
Doktora
Türkçe
2024
FizyolojiEge ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BUKET KOSOVA
PROF. DR. OĞUZ GÖZEN
- Gliklazid ve insülin tedavisinin streptozotosinle diabet oluşturulmuş rat hipokampus NMDA reseptör subtip konsantrasyonlarına etkisi
Effects of gliclozide and insulin treatment on hippocampel NMDA receptor subtype concentrations in streptozotocin diabetic rats
İBRAHİM KILINÇ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2003
BiyokimyaSüleyman Demirel ÜniversitesiBiyokimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NAMIK DELİBAŞ