Production of recombinant antibody fragments in bacteria and their development towards medical diagnosis
Rekombinant antikor fragmanlarının bakterilerde üretimi ve tıbbi tanıya yönelik geliştirilmesi
- Tez No: 695041
- Danışmanlar: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR, PROF. DR. MATTHEW P. DELISA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya Mühendisliği, Chemical Engineering
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2021
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 178
Özet
Antikorlar ve antikor türevleri, teşhis ve tedavi edici uygulamalar ile biyoteknolojik araştırmalarda geniş bir kullanım alanına sahiptir. Bu alanlardaki uygulamaları yüksek verimle üretimlerini gerektirmesinden dolayı, antikorların küresel pazarda artan taleplerini karşılamak ve üretim maliyetlerini azaltmak için rekombinant protein teknolojisi kullanılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan rekombinant antikor fragmanlarından biri olan tek zincirli değişken fragman (scFv), ağır ve hafif değişken bölgelerin esnek bir bağlayıcı peptit ile bağlanmasıyla oluşturulur. Scfv yapılarının özellikleri, değişken bölgelerin bağlanma sırası ile bağlayıcı peptitlerin içeriğine, uzunluğuna ve esnekliğine bağlı olarak değişmektedir. Bu tez çalışmasında, çözünür, aktif ve doğru katlanmış scFv'lerin Escherichia coli bakterisinde üretimleri önerilmiş, bağlayıcı peptitlerin scFv'lerin diagnostik uygulamalarda immobilizasyonuna yönelik etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, insan epidermal büyüme reseptörü 2 (HER2)'ye karşı anti-HER2 scFv ve β-galaktosidaza karşı scFv13R4, model antikor fragmanları olarak seçilmiştir. İlk olarak, meme kanseri hastalarında normalden fazla üretilen HER2 glikoproteinini hedefleyen tam uzunluktaki antikorun scFv versiyonu, örtüşme uzantısı ile ekleme polimeraz zincir reaksiyonu (SOE-PCR) ile oluşturulmuştur. Anti-HER2 scFv, fonksiyonel üretimi için uygun hücrenin belirlenebilmesi amacıyla E. coli BL21(DE3) ve disülfid bağı oluşumu için sitoplazmasında daha fazla oksitleyici koşullara sahip E. coli SHuffle T7 Express hücrelerinin sitoplazmalarında üretilmiştir. Hücrelerin karşılaştırılması, BL21(DE3)'e karşı SHuffle T7 Express'te üretilen anti-HER scFv'nin önemli ölçüde daha yüksek çözünürlük ve dört kata kadar daha yüksek antijen bağlama aktivitesi ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle, scFv'lerin ilerleyen çalışmalardaki üretimleri SHuffle T7 Express ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonra anti-HER2 scFv, özellikleri açısından en uygun bağlanma sırasının belirlenebilmesi için VH-bağlayıcı-VL ve VL-bağlayıcı-VH olarak tasarlanmıştır. Çözünürlük, monomer/dimer oluşumu, bağlanma aktivitesi ve afinite özelliklerinin karşılaştırılması amacı ile SHuffle hücrelerinde üretilmiştir. Çözünür üretimleri Western blot analizi ile karakterize edilirken, anti-HER2 scFv'nin in vitro immünolojik karakterizasyonu enzim bağlı immünosorbent analizi (ELISA) ve yüzey plazmon rezonans (SPR) analizi ile yapılmıştır. Sonuç olarak, anti-HER2 scFv'nin oluşturulmasında değişken alanların bağlanma sırası ilk defa bu çalışma ile araştırılmış; anti-HER2 scFv, değişken alanların bağlanma sırasından bağımsız olarak, her iki yapıda da HER2'ye karşı yüksek bağlanma aktivitesi ve seçicilik göstermiştir. Ayrıca, indükleme sıcaklığı, indükleyici (IPTG) derişimi, indükleme süresi ve ortam bileşimi gibi biyoproses işletim koşullarının scFv üretimine etkileri de araştırılmıştır. IPTG derişiminin anti-HER2 scFv üretimini önemli ölçüde etkilemediği, indükleme sonrası 16-20 sa aralığında daha yüksek miktarda çözünür scFv üretildiği ve 30°C'den düşük sıcaklıklarda çözünür protein oranının arttığı sonucuna varılmıştır. SHuffle hücrelerinde kimyasal olarak tanımlanmış minimal ortamda da anti-HER2 scFv üretimi gözlenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde, daha yüksek protein üretimi sebebiyle VL-bağlayıcı-VH yapısında anti-HER2 scFv kullanılmıştır. ScFv'ler polistiren (PS) yüzeylere immobilizasyona yönelik farklı amino asit bileşimine sahip bağlayıcılar ile yeniden tasarlanmış ve yeni scFv'lerin özellikleri incelenmiştir. İmmobilizasyonun, antijene bağlanma özelliklerinin ve HER2'nin tespit edilebilirliğinin belirlenmesi için sırasıyla direkt, indirekt ve sandviç ELISA yöntemleri uygulanmıştır. Farklı bağlayıcılara sahip scFv'lerin immobilizasyon aktivitelerinin PS plaka tipine ve scFv kaplama çözeltisinin Tween 20 içerip içermemesine bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. Ayrıca, bağlayıcıların başka scFv'lerde etkisini anlamak için aynı bağlayıcılar bir diğer model antikor fragmanı scFv13R4 yapısına da eklenmiş ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. Son olarak, bağlayıcı peptitlerin anti-HER2 scFv'lerin stabilitesi ve işlevselliği üzerindeki etkilerini gözlemlemek için homoloji modelleme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonu yöntemleri ile in silico analiz yapılmıştır. Deneysel sonuçlar ve MD simülasyonlarına dayanarak, tasarlanan bağlayıcılardan birinin immünoanaliz uygulamaları için standart bağlayıcıya uygun bir alternatif olabileceği sonucuna varılmıştır. Genel olarak, bu çalışmada oluşturulan model scFv'ler çözünebilir ve biyolojik olarak aktif üretilebilmeleri ile nM düzeyde ayrışma sabitlerine (Kd) sahip olmaları nedeniyle, immünoanalizlerde veya tanı araçlarında biyolojik tanıma elemanları olarak kullanım potansiyeline sahiptir.
Özet (Çeviri)
Antibodies and antibody derivatives have been widely used in diagnostic and therapeutic applications as well as in biotechnological research tools. Since their application in these areas requires for their production with a high yield, recombinant protein technology has been used to meet the increasing demand in the global market and to reduce production costs. Single-chain variable fragment (scFv), which is one of the most widely used recombinant antibody fragments, is formed by linking heavy and light units of variable domains with a flexible linker peptide. Successful construction of scFvs is based on composition, length and flexibility of linker peptides in addition to variable domain order. In this thesis, the production of model scFvs, that are highly soluble, active and correctly folded in Escherichia coli was proposed and the effects of linker peptides to properties of scFvs towards immobilization for diagnostic applications were investigated. For this purpose, anti-HER2 scFv against human epidermal growth receptor 2 (HER2) and scFv13R4 against β-galactosidase were selected as model antibody fragments. Firstly, scFv version of the full-length antibody targeting HER2 glycoprotein, which overexpresses in breast cancer patients, was constructed via splicing by overlap extension polymerase chain reaction (SOE-PCR). Anti-HER2 scFv was expressed in the cytoplasm of E. coli strains BL21(DE3) and SHuffle T7 Express cells, the latter of which has more oxidizing conditions for disulfide bond formation, to determine the suitable strain for functional production of the scFv. Evaluation of the host strains revealed significantly higher solubility and up to four-fold higher antigen-binding activity of anti-HER2 scFv expressed in SHuffle T7 Express versus BL21(DE3). Hence, subsequent productions of scFvs were performed in SHuffle T7 Express. Thereafter, anti-HER2 scFvs were designed in two different domain orientations, which were VH-linker-VL or VL-linker-VH, to determine the optimum domain orientation for this scFv. They were expressed in SHuffle cells to compare their properties in terms of solubility, monomer/dimer formation, binding activity and affinity. Soluble production was characterized by Western blot analysis, and in vitro immunological characterization of anti-HER2-scFv was performed with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and surface plasmon resonance (SPR). Consequently, domain orientation of anti-HER2 scFv was investigated for the first time, and each scFv showed high binding activity and selectivity against HER2, regardless of the variable domain orientation. In addition, effects of bioprocess operation parameters such as induction temperature, inducer concentration, duration of induction and medium composition on expression of scFvs were investigated. It was found that IPTG concentration did not significantly affect the anti-HER2 scFv expression, higher amount of soluble anti-HER2 scFvs were observed between 16-20 h after induction and ratio of soluble expression increased at temperatures lower than 30°C. Overexpression of anti-HER2 scFv was also observed when produced in chemically defined minimal medium in SHuffle cells. In the second part of the study, anti-HER2 scFv in VL-linker-VH orientation was used, owing to its relatively higher expression. ScFvs were re-designed by adding linkers with different amino acid composition, towards immobilization onto polystyrene (PS) surfaces and characteristics of the new scFvs were investigated. Direct, indirect and sandwich ELISA was performed for determination of immobilization, antigen-binding properties and detection of HER2, respectively. It was observed that the immobilization activities of scFvs with different linkers changed in relation to PS plate type, and absence or presence of Tween 20 in coating buffer. Additionally, the same linkers were cloned into the other model antibody fragment, scFv13R4, to investigate the versatility of the effects of linkers and similar results were observed. Lastly, in silico analysis was performed to observe the effect of linkers on stability and functionality of anti-HER2 scFvs with homology modelling and molecular dynamics (MD) simulation. Based on the experimental results and MD simulations, one of the designed linkers was found to be an appropriate substitution for the standard linker within the scFvs for immunoassay applications. Overall, the model scFvs constructed in this study hold great potential as biorecognition elements in immunoassays or diagnostic tools owing to their highly soluble expression and biologically active forms with nM range dissociation constants (Kd).
Benzer Tezler
- Development and structural determination of antiangiogenic recombinant antibody structures for cancer treatment
Kanser tedavisine yönelik antianjiogenik rekombinant antikor yapılarının geliştirilmesi ve yapısal tayini
MELİS DENİZCİ ÖNCÜ
Doktora
İngilizce
2022
Biyomühendislikİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. GİZEM DİNLER DOĞANAY
DR. AYLİN ÖZDEMİR BAHADIR
- Kanserde p53 mutasyon analizi için immünolojik tanı yöntemlerinin geliştirilmesi
Development of immunological diagnostic procedures for detecion of p53 mutation in all human canser
ESMA YOLCU
- Rekombinant antikor fragmentlerinin üretimi ve genetik modifikasyonuyla sitokin ölçümüne yönelik immünoassay geliştirilmesi
Production and genetic modification of antibody fragments for development of a cytokine detection immunoassay
DİLEK ŞAHİNBAŞ
Doktora
Türkçe
2024
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
- Anti-HER2 scFV antikor fragmanının Escherichia coli bakterisinde üretim bölgesinin optimizasyonu
Optimization of anti-HER2 scFV antibody fragment production region in Escherichia coli
SELEN CİLASUN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyomühendislikHacettepe ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
- Rekombinant DNA teknolojisi ile rekombinant bir antijene karşı antikor üretimi
Production of antibody against a recombinant antigen by using recombinant DNA techniques
IŞIN NERGİZ GEREN
Doktora
Türkçe
1999
Tıbbi BiyolojiMarmara ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. BEYAZIT ÇIRAKOĞLU