Geri Dön

Anti-HER2 scFV antikor fragmanının Escherichia coli bakterisinde üretim bölgesinin optimizasyonu

Optimization of anti-HER2 scFV antibody fragment production region in Escherichia coli

PDF İndir

  1. Tez No: 798281
  2. Yazar: SELEN CİLASUN
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyomühendislik, Genetik, Bioengineering, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 88

Özet

Antikorlar ve antikor fragmentleri, kanser ve viral enfeksiyonlar gibi çeşitli hastalıkların tanısında, görüntülemede ve hedefe özgü tedavilerde kullanılmaktadır. Bulaşıcı hastalıklarla mücadelede de önemli bir yere sahiptir. Esnek bir peptit parçası ile bir hafif zincirin V kısmına bağlanmış bir ağır zincirin V kısmından oluşan tek-zincir antikor fragmentleri (scFv), daha küçük boyutlarda olması, bakteri sistemlerinde daha ucuz ve kolaylıkla üretilebilmesi ve hedef antijene karşı, antikorlara benzer düzeyde, yüksek seçicilik ve afinite göstermelerinden dolayı, son zamanlarda tam-antikorlar yerine kullanılabilmektedir. Biyofarmasötik proteinler küresel ilaç pazarının yaklaşık yarıya yakınını oluşturmaktadır. Biyofarmasötik ürünlerin çoğunluğunu monoklonal antikor ve antikor fragmentleri kapsamaktadır. Rekombinant protein üretiminde yaygın olarak kullanılan Escherichia coli'nin, üretim maliyetlerini düşürdüğü, verimliliğin arttırdığı ve diğer mikroorganizmalara kıyasla manipülasyonu daha kolay olduğu bilinmektedir. Literatürde, disülfit bağı içeren anti-HER2 scFv'nin optimum üretim yerinin belirlenmesine yönelik E. coli'nin üç farklı bölmesindeki üretimlerin bir arada olduğu, bu bölgelere özgü farklı yolakları kullanan birbirinden farklı sinyal peptitleri ve suş kullanılarak karşılaştırılmasına ve üç bölme arasında optimum üretim yerinin belirlenmesine yönelik bir çalışma bulunmamaktadır. Yapılan tez çalışmasında, meme kanseri hücrelerinde normalden fazla miktarda ortaya çıkan insan epidermal büyüme reseptörü 2 (HER2)'ye karşı seçici anti-HER2 scFv'nin, genetiği değiştirilmiş ticari E. coli bakterisinin SHuffle T7 Express suşunda sitoplazmik bölgede üretimi, BL21(DE3) suşunda DsbA, MBP sinyal peptitleri kullanarak yapılan tasarımla periplazmik ve YebF sinyal peptidi kullanarak yapılan tasarımla hücre dışında üretimleri karşılaştırılmıştır. Üretim sonrası >99% oranında saflaştırılan scFv'lerin, çözünür ve aktif formda oldukları yapılan çalışmada gösterilmiştir. Sıcaklık taraması yapılarak, üretim için uygun sıcaklık belirlenmiştir. Üretim sürecinin optimize edilmesinin ardından scFv'ler farklı yönleri ile kıyaslanmıştır. Özgüllükleri değerlendirilen periplazmik, sitoplazmik ve ekstraselüler örnekler, in vitro analizlerde antijene doğru şekilde bağlanmıştır. Sitoplazmik örneğin üretim verimi 6,2 mg/L iken, spMBP ile yapılan periplazmik üretimin verimi 5,1 mg/L, hücre dışı üretim verimi ise 2,5 mg/L olarak bulunmuştur. Ayrıca, özgül ısı ve erime sıcaklıklarına (Tm) bakıldığında, sitoplazmik örneğin termal olarak daha kararlı olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Özetle bu çalışma, tıbbi tanı ve tedavide rol oynayan, rekombinant DNA teknolojisi ile üretilecek ve disülfit bağı içeren proteinlerin üretim maliyetlerini azaltım sürecine rehberlik edebilecek bir çalışma olmuştur. Özellikle anti-HER2 scFv'nin aktif ve çözünür formdaki üretimi, kompleks proteinlere özgü yöntemler ve suşlar kullanarak E. coli'de klonlanması ve farklı yönleriyle değerlendirilmesi literatüre önemli bir katkı sağlayacaktır.

Özet (Çeviri)

Antibodies and antibody fragments are used in the diagnosis, imaging, and target-specific treatments of various diseases such as cancer and viral infections. It also has an important place in combating infectious diseases. Single-chain antibody fragments (scFv), which consist of a flexible peptide fragment and the V portion of a heavy chain linked to the V portion of a light chain, are smaller in size, can be produced more cheaply and easily in bacterial systems, and have a high selectivity against the target antigen, similar to antibodies, and due to their affinity, they have recently become an alternative to full-antibodies. Biopharmaceutical proteins make up nearly half of the global pharmaceutical market. The majority of biopharmaceutical products include monoclonal antibody and antibody fragments. It is known that Escherichia coli, which is widely used in recombinant protein production, reduces production costs, increases productivity and is easier to manipulate compared to other microorganisms. There is a lack of study in literature in order to determine the optimum production site of anti-HER2 scFv containing disulfide bonds, in which the productions in three different compartments of E. coli are coexisting, comparing using different signal peptides and strains, via different pathways specific to these regions. In the thesis study, productions of selective anti-HER2 scFv against human epidermal growth receptor 2 (HER2), which occur in excessive amounts in breast cancer cells, were compared for three different compartments, periplasmic, cytoplasmic and extracellular. The commercial and genetically modified E. coli SHuffle T7 Express strain was used for the cytoplasmic production. Designs including DsbA and MBP signal peptides were used for periplasmic region, while the design with the YebF signal peptide was used for extracellular secretion. It has been shown in the study that the scFvs purified at a ratio of >99% after production are in soluble and active form. The most suitable temperature for production was determined by screening the induction temperature. After optimizing the production process, scFvs were compared in different features. Periplasmic, cytoplasmic, and extracellular samples whose specificities were evaluated were correctly bound to antigen in the in vitro assays. While the production yield of the cytoplasmic sample was 6.2 mg/L, the yield of periplasmic production with spMBP was 5.1 mg/L and the extracellular production efficiency was 2.5 mg/L. In addition, when the specific heat and melting temperatures (Tm) were examined, it is concluded that the cytoplasmic sample is more thermally stable. Overall, this study has been a guide for the process of reducing the production costs of recombinant proteins that play a role in medical diagnosis and treatment. In particular, the production of anti-HER2 scFv in active and soluble form, its cloning in E. coli using complex protein-specific methods and strains, and evaluation of its different aspects will make an important contribution to the literature.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    695041

    Production of recombinant antibody fragments in bacteria and their development towards medical diagnosis

    Rekombinant antikor fragmanlarının bakterilerde üretimi ve tıbbi tanıya yönelik geliştirilmesi

    İLKAY KOÇER KULOĞLU

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Kimya MühendisliğiHacettepe Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. EDA ÇELİK AKDUR

    PROF. DR. MATTHEW P. DELISA

  2. Tez No

    861882

    Anti-HER2 tedavi alan meme karsinomu tanılı hastalarda kardiyotoksisite oranlarının retrospektif olarak değerlendirilmesi

    Retrospective evaluation of cardiotoxicity rates in patients diagnosed with breast carcinoma receiving anti-HER2 treatment

    DENİZ BAKIRCIOĞLU ALP

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    OnkolojiDokuz Eylül Üniversitesi

    İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ELİF ATAĞ AKYÜREK

  3. Tez No

    479557

    Rekombinant anti-HER2 antikoru üretimi için ekspresyon vektörü geliştirilmesi ve konak hücrede ekspresyonunun gösterilmesi

    Development expression vector for recombinant anti-HER2 antibody production and demonstration of expression in the host cell

    AYTÜL GÜL

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyomühendislikEge Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. SULTAN GÜLÇE İZ

  4. Tez No

    348703

    Toward anti-cancer drugs: Selection of anti-VEGF and anti-HER2 aptamer to inhibit cancer biomarkers

    Anti-kanser ilaçlarına doğru: Kanser biyoişaretleyicilerini engelleyen anti-VEGF ve anti-HER2 aptamerlerinin seçimi

    IRENA ROÇİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2012

    BiyomühendislikSabancı Üniversitesi

    Biyoloji Bilimleri ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. JAVED HUSSAİN NİAZİ

  5. Tez No

    436352

    Elucidating the mechanisms of T-DM1 resistance in in vitro models of HER2 overexpressing breast cancer

    HER2-pozitif meme kanseri hücre modellerinde T-DM1 direncinin mekanizmalarının açığa çıkarılması

    ÖZGE SAATCİ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    Bilim ve Teknolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. ÖZGÜR ŞAHİN

Geri Dön