Geri Dön

Development and immunological evaluation of SARS-CoV-2 virus-like particles (VLP) expressing the prefusion stabilized variants of the spike protein

Prefüzyon stabilize Spike proteini varyantlarını taşıyan SARS-CoV-2 virüs benzeri parçacıkların geliştirilmesi ve immünolojik değerlendirilmesi̇

  1. Tez No: 715663
  2. Yazar: EMRE MERT İPEKOĞLU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. MAYDA GÜRSEL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Biyoloji, Moleküler Tıp, Allergy and Immunology, Biology, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 147

Özet

Coronavirüs hastalığı 2019 (COVID-19), 2019'un sonlarında Çin'in Wuhan kentinde ortaya çıkmıştır ve nedensel ajanı Şiddetli Akut Solunum Sendromu Coronavirüs 2 (SARS-CoV-2) olarak tanımlanmıştır. Bu son derece bulaşıcı virüs, COVID-19 pandemisine yol açan yeni bir pnömoni salgınına neden olmuştur. COVID-19 pandemisinin ortaya çıkması, SARS-CoV-2'ye karşı etkili bir aşıya acilen ihtiyaç duyulmasına sebebiyet vermiştir. SARS-CoV-2'ye karşı bir aşı adayı üretmek için etkili bir strateji, SARS-CoV-2'nin yapısal proteinlerinin (Spike, Membran, Zarf ve Nükleokapsid proteinlerinin) kendi kendine bir araya gelme özelliğinin kullanılarak Virüs benzeri partikülleri (VLP) oluşturmasına dayanmaktadır. İlk çalışmalarımız, memeli konakçı hücre ifadesi için virüsün dört yapısal proteinini kodlayan genlerinin transfeksiyonu yoluyla memeli hücresinden üretilen immünojenik SARS-CoV-2 VLP'lerin laboratuvar ölçeğinde üretimine odaklanmıştır. Burada, prefüzyon stabilize (2p) veya termostabil altı prolin (6p; HexaPro) Spike proteinini barındıran SARS-CoV-2 VLP'lerin ölçeklenebilir üretimi ve saflaştırılması için bir süreç geliştirme çerçevesi açıkladık. Sonuçlarımız, süspansiyon kültüre adapte edilmiş vii HEK hücrelerinin, çok-modlu kromatografi ve teğetsel akış filtrasyonu gibi ölçeklenebilir saflaştırma tekniklerinin uygulanmasının ardından, otantik SARS- CoV-2 virionlarına benzer boyutlarda dört yapısal proteini içeren VLP'ler üretebildiğini göstermiştir. Bu çalışmada ayrıca, farelerde VLP'nin ortaya çıkardığı anti-Spike immünoglobulinlerini izlemek ve serolojik testler yapmak için SARS-CoV-2'nin 6x histidin etiketli rekombinant Spike (6p) proteinini ürettik ve afinite saflaştırması yöntemi ile elde ettik. Sonuçlarımız, ELISA deneylerinin tekrarlanabilirliği ve standardizasyonu açısından, Spike proteininin saflaştırılması için uyarlanmış güncel bir protokolün, salgılanan rekombinant proteinler için kullanılan geleneksel afinite saflaştırma tekniklerinden üstün olduğunu göstermiştir. Son olarak, K3 CpG ODN ve/veya Alum içeren aşı adjuvanları ile kombinasyon halinde, 2p ve 6p Spike proteinlerini barındıran VLP'lerin bağışıklık koruyucu potansiyelini inceledik. Toplu sonuçlarımız Alum tarafından adsorbe edilmiş, K3 CpG ile adjuvanlanmış yüksek doz 6p VLP'lerin, adjuvanlanmamış, düşük doz veya 2p VLP karşıtlarına kıyasla aşılanmış BALB/c farelerde güçlü hümoral ve hücresel bağışıklık tepkileri ortaya çıkardığını ve SARS-CoV-2'ye karşı bir etkili aşı adayı olabileceğini ortaya koyarken, aynı zamanda bu aşı adayının insan klinik deneylerinde değerlendirilmesi için bir gerekçe sağlamaktadır

Özet (Çeviri)

Emergence of the COVID-19 pandemic necessitated rapid development of highly effective vaccines against SARS-CoV-2. One adaptable strategy to produce a vaccine candidate against SARS-CoV-2 is based on the exploitation of the self- assembly feature of the structural proteins of SARS-CoV-2: Spike, Membrane, Envelope and Nucleocapsid, forming Virus-like particles (VLP). Our early studies focused on laboratory-scale production of SARS-CoV-2 VLPs in a mammalian host cell system based on transient expression of viral proteins. Herein, we describe a process development framework for scalable production and purification of SARS- CoV-2 VLPs expressing either the prefusion stabilized (2p) or the thermostable six proline (6p; HexaPro) stabilized Spike proteins. Results showed that suspension culture-adapted HEK 293 cells were able to produce vesicular VLPs that were similar in size to the authentic SARS-CoV-2 virions. Combined use of multimodal chromatography, nucleic acid removal through Denarase treatment and tangential flow filtration,enabled large-scale production of the SARS-CoV-2 VLPs. v In this study, we also produced and affinity purified 6x histidine-tagged recombinant Spike (6p) protein of SARS-CoV-2 to conduct in-house serological assays to monitor VLP vaccine-induced anti-Spike immunoglobulin response in immunized mice. Our results demonstrated that a modified purification protocol was superior to conventional affinity purification technique for the production of the secreted recombinant protein in terms of reproducibility and standardization of ELISA experiments. Finally, we examined the immunogenicity of 2p and 6p Spike harbouring VLPs combined with vaccine adjuvants K3 CpG ODN and/or Alum. Collectively, our results suggest that Alum adsorbed, K3 CpG adjuvanted high dose 6p VLPs elicited robust humoral and cellular immune responses in vaccinated BALB/c mice as compared to non-adjuvanted, low dose or 2p VLP counterparts, proving the effectiveness of this formulation as a vaccine candidate against SARS-CoV-2.

Benzer Tezler

  1. Farelerde yeni yağ bazlı aşı adjuvanlarının toksikolojik ve immünolojik potansiyelinin değerlendirmesi

    Toxicological and immunological evaluation of novel oil-based vaccine adjuvants potential in mice

    KARRAR ALI MOHAMMED HASAN AL SAKINI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyoteknolojiEge Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE NALBANTSOY

  2. Topikal psoriazis tedavisi için nano boyutlu ilaç taşıyıcı sistemlerin geliştirilmesi ve in vitro modeller ile değerlendirilmesi

    Development and evaluation of nanosized drug delivery systems for topical psoriasis treatment with in vitro models

    MERIEM REZIGUE

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Eczacılık ve Farmakolojiİstanbul Üniversitesi

    Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SEVGİ GÜNGÖR

  3. Koyun kalp kapakçığının hücresizleştirilmesiyle rejeneratif insan kalp kapakçığının geliştirilmesi ve etkinliğinin değerlendirilmesi

    Development and evaluation of the efficacy of regenerative human heart valve by decellularization of sheep heart valve

    MÜSLÜM SÜLEYMAN İNAL

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    BiyomühendislikBilecik Şeyh Edebali Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CİHAN DARCAN

    DOÇ. DR. ALİ AKPEK

  4. Siklosporinin yeni oral nanoformülasyonunun geliştirilmesi ve in vitro/in vivo değerlendirilmesi

    Development and in vitro/in vivo evaluation of cyclosporine new oral nanoformulation

    SILA GÜLBAĞ PINAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Eczacılık ve FarmakolojiGazi Üniversitesi

    Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FATMA NEVİN ÇELEBİ

  5. Polikistik over hastalarında oosit ve embriyo gelişiminin değerlendirilmesi

    Evaluation of oocyte and embryo development in patients with polycystic ovary

    ARLİN ÇAĞLI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Histoloji ve Embriyolojiİstanbul Yeni Yüzyıl Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TÜLAY İREZ