Geri Dön

Development and characterization of CpG adjuvanted SARS-CoV-2 virus-like particle vaccine

CpG adjuvantlı SARS-CoV-2 virüs benzeri parçacık aşısının geliştirilmesi ve karakterizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 737559
  2. Yazar: NİLSU TURAY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. İHSAN GÜRSEL
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Allerji ve İmmünoloji, Allergy and Immunology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi
  10. Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 131

Özet

SARS-CoV-2 virüsü 2019 yılının sonlarında ortaya çıkmıştır, çok sayıda vakaya ve ölüme yol açması nedeniyle günümüzün şiddetli pandemilerinden biri olarak kabul edilmiştir. SARS-CoV-2'nin yol açtığı hastaneye yatış ve ölüm oranlarını azaltmak için bu virüse karşı acil aşı geliştirme ihtiyacı ortaya çıkmıştır. SARS-CoV-2, 4 yapısal protein içerir; Nükleokapsit (N), Zarf (E), Membran (M) ve Taç (S). S antijenini hedef alan çok sayıda aşı geliştirilmiş ve geliştirilen aşılar sağlıklı gönüllüler üzerinde test edilmiştir. Otantik ve varyant virüslerin yapısını, morfolojisini ve konformasyonunu taklit edebilen Virüs Benzeri Parçacıklar (VLP'ler), aşı platformları arasındaki diğer aşı adaylarına kıyasla daha iyi koruma sağlama potansiyeline sahiptirler. VLP aşıları multivalan antijen sunum kapasiteleri ve farklı Spike varyantlarını ifade edebilme kolaylığı nedeniyle güçlü bir hücresel ve hümoral bağışıklığa yol açmaktadır. Bu projede; memeli hücreleri tarafından üretilen, 4 yapısal proteini içeren SARS-CoV-2 VLP aşı adayının üretimini, pürifikasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. İki farklı CpG ODN ile formüle edilen aşı adayının immünojenisitesi ve immün koruyuculuğu çeşitli hayvan modelleri kullanılarak araştırılmıştır. İlk olarak, SARS-CoV-2'nin 4 yapısal protein dizisi iki ayrı ikili ekspresyon plazmidine klonlanmıştır ve HEK293-FT hücreleri bu plazmitler kullanılarak geçici olarak transfekte edilmiştir. Hücre kültürü süpernatantındaki VLP'ler günlük olarak takip edilmiştir ve saflaştırmadan sonra VLP'lerin üzerindeki yapısal proteinler immünoblotlama yoluyla tespit edilmiştir. Ayrıca, sonuçlarımız VLP'lerin boyutlarının otantik SARS-CoV-2 virüslerine benzediğini göstermiştir. VLP'ler saflaştırıldıktan ve karakterize edildikten sonra, adjuvanlanmış VLP'lerin immünojenisitesinin değerlendirilmesi için BALB/c fareler deri altı (sc) aşılama tekniği ile immünize edilmiş ve serumları ELISA metodu ile değerlendirilmiştir. Geliştirilen aşının toksisitesinin değerlendirilmesi için aşı adayının en yüksek insan dozu, dişi Sprague Dawley sıçanlarının deri altına enjekte edilmiştir. Son olarak, aşı adayının immün koruyucu etkisini göstermek adına transgenik K18-hACE2 fareleri kullanılarak sınama (challenge) çalışmaları yapılmıştır. Sonuçlar, VLP'lerin, CpG ODN'ler ile adjuvanlandığında virüse karşı güçlü hümoral ve Th1 taraflı hücresel tepkileri indüklediğini göstermiştir. Ayrıca, aşı formülasyonunun, sıçanlar üzerinde yapılan tekrarlanan doz toksisitesi çalışmalarında herhangi bir önemli sistemik etkiye yol açmadığı gösterilmiştir. Fare sınama deneylerinde ise aşı adayı, canlı SARS-CoV-2 virüsüne karşı güçlü bir immün koruması oluşturmuştur. Sonuçlarımız, bu aşı adayının insan klinik deneylerinde kullanılabileceğini göstermiştir. Bu tezin ikinci bölümünde, SARS-CoV-2 rekombinant RBD ve Nükleokapsit proteinleri üretilmiş ve afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. 6X Histidin etiketli RBD ve N proteinleri HEK293-FT hücrelerinde üretildikten sonra, süpernatant, immobilize metal afinite kromatografisi (IMAC) kolonundan geçirilmiştir. Üretilen proteinlerin kalitesi; gümüş boyama ve western blotlama ile gözlemlenmiştir. Daha sonra, saflaştırılan rekombinant proteinlerin optimal konsantrasyonu bağışıklanmış farelerin serumları kullanılarak belirlenmiş ve sonraki ELISA deneylerinde saflaştırılan rekombinant proteinler kullanılmıştır.

Özet (Çeviri)

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) appeared in late 2019, led to countless cases and deaths and eventually regarded as one of the severe pandemics of modern times. To reduce hospitalization and mortality rates against COVID-19 an immediate need for effective vaccines has emerged. SARS-CoV-2 contains 4 structural proteins; Nucleocapsid (N), Envelope (E), Membrane (M) and Spike (S). Numerous vaccine platforms targeting Spike antigen were developed and tested on healthy volunteers. Among vaccine platforms, Virus-Like Particles (VLPs) capable of mimicking the structure, morphology and conformation of authentic and variant viruses offer a selective advantage for a better protection. VLPs, due to multivalent antigen display capabilities and ease of expressing different Spike variants can elicit cellular, as well as humoral immune responses and were expected to be superior to that of other COVID-19 vaccine platforms. Herein, we produced, purified and characterized the first mammalian derived, 4 structural protein containing SARS-CoV-2 VLP vaccine. Various animal models were used to assess the immunogenicity and immuno-protective potential of the candidate VLP vaccine that was formulated with two different CpG ODN adjuvants. Following cloning of four viral structural proteins to two separate dual expression plasmids and transiently transfecting them to adherent HEK293-FT cells, VLP yields were monitored daily from cell culture supernatant. Presence of SARS-CoV-2 structural proteins on VLPs were verified via immunoblotting. Furthermore, the size of VLPs was investigated and was shown to resemble to that of authentic SARS-CoV-2. To assess in vivo immunogenicity of the adjuvanted VLPs, BALB/c mice were subcutaneously (sc) immunized and end point titer ELISA was studied from sera. For the toxicity assay of the candidate VLP vaccine, the selected highest human dose was sc injected to female Sprague Dawley rats. Lastly, to show the immunoprotective effect of the VLP vaccine, challenge studies were conducted with transgenic K18-hACE2. Results demonstrated that VLPs induce robust antiviral humoral and Th1-biased cellular responses when adjuvanted with CpG ODNs. Furthermore, VLP immunization did not lead to any significant systemic effect during repeated dose toxicity studies on rats. A robust immuno-protection against the live SARS-CoV-2 virus was observed with the challenge experiments. Collectively, the results provide the rationale for using this vaccine candidate in human clinical trials. In the second part of the thesis, SARS-CoV-2 recombinant RBD and Nucleocapsid proteins were produced and purified via affinity chromatography. After 6X Histidine- tagged RBD and N were produced in HEK293-FT cells, supernatant passed through the immobilized metal affinity chromatography (IMAC) column. Quality of the recombinant proteins was investigated using silver staining and western blotting. Afterward, immunized mice sera were used to find an optimal coating concentration of the purified recombinant proteins. Finally, purified recombinant proteins were used in in-house ELISA experiments.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    858202

    Development and preclinical characterization of meningococcal outer membrane vesicle vaccine

    Meningokokkal dış membran vezikül aşısının geliştirilmesi ve preklinik karakterizasyonu

    YASEMİN ÖZSÜREKCİ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Allerji ve İmmünolojiİhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İHSAN GÜRSEL

  2. Tez No

    375114

    DNA metiltransferaz ve metil bağlayan bölge proteinlerini hedefleyen miRNA gen polimorfizmlerinin akciğer kanseri ile ilişkisinin belirlenmesi

    Determination of association between polymorphisms of miRNA genes targeting dna methyltransferases and methyl binding proteins with lung cancer

    CANSU ÖZBAYER

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2014

    Tıbbi BiyolojiEskişehir Osmangazi Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. İRFAN DEĞİRMENCİ

  3. Tez No

    442002

    Targeted delivery of CpG-oligodeoxynucleotide to breast cancer cells by poly-amidoamine dendrimer-modified magnetic nanoparticles

    CpG-oligodeoksinükleotitlerin meme kanseri hücrelerine poli-amidoamin dendrimer kaplı manyetik nanoparçacıklar ile hedeflenmesi

    NEGAR TAGHAVİ POURİANAZAR

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. UFUK GÜNDÜZ

    PROF. DR. GÜNGÖR GÜNDÜZ

  4. Tez No

    877766

    Characterization and production of lysin from MET P1-301 bacteriophage for biocontrol approaches against pathogenic Escherichia coli

    Patojenik Escherichia coli'ye karşi biyokontrol yaklaşimlari için MET P1-301 bakteri̇yofajindan li̇zi̇n karakteri̇zasyonu ve üreti̇mi̇

    AYŞENUR YÜCEFAYDALI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    Gıda MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. YEŞİM SOYER KÜÇÜKŞENEL

  5. Tez No

    768074

    Development and characterization of recycled polymers by using natural fibers

    Doğal lif kullanılarak geri dönüşümlü polimerlerin geliştirilmesi ve karakterizasyonu

    HASAN MAHMOOD KAEDHI KAEDHI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Makine MühendisliğiAltınbaş Üniversitesi

    Makine Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. YASER ALAIWI

Geri Dön