Geri Dön

The use of CRISPR/DCAS9 engineered mscs to prevent cisplatin-induced cellular damage in human granulosa cells

Sisplatin ile indüklenen insan granüloza hücrelerinde ki hücre hasarini önlemek için CRİSPR/DCAS9 tasarlanmiş MSC'lerin kullanimi

PDF İndir

  1. Tez No: 762057
  2. Yazar: MEHMET YUNUS ÇOMAR
  3. Danışmanlar: DR. SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biyoteknoloji, Kadın Hastalıkları ve Doğum, Biology, Biotechnology, Obstetrics and Gynecology
  6. Anahtar Kelimeler: Mezenkimal Kök Hücreler, İnfertilite, CRISPR/dCas9, Eksozomlar, Kanser, Mesenchymal Stem Cells, Cisplatin, CRISPR/dCas9, Exosomes, Cancer, Infertility
  7. Yıl: 2022
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Üreme Biyolojisi Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 108

Özet

Kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı, kadınlarda kemoterapi alan kadınlarda yumurtalıkların işlevini geçici veya kalıcı olarak yitirebildiği bir durumdur ve yumurtalık disfonksiyonunda düşük östrojen serum seviyesi, amenore ve infertilite gibi belirtiler görülebilir . Cisplatin, tüm yumurtalık hücreleri üzerinde gonadotoksik etkisi olan platin bazlı bir antikanser kemoterapötik ilaçtır. Kök hücreler, özellikle yetişkin bir kök hücre olan mezenkimal kök hücreler kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarı için yardımcı bir tedavi olarak denenmektedir. CRISPR genom düzenleme teknolojisi, en yaygın olarak kullanılan gen düzenleme sistemidir ve nükleaz etkisinden yoksun dCas9 (ölü Cas9), bir CRISPR aktivasyon aracıdır. Bir sinerjistik aktivasyon aracısı (SAM), iki MS2 aptameri dahil olmak üzere modifiye edilmiş bir sgRNA ile entegre edilmiş dCas9-VP64 füzyon proteininden oluşan bir CRISPR/dCas9 aktivasyon sistemidir. MS2 bağlayıcı proteini, diğer iki aktivatör alanı olan p65 ve HSF1 ile birleştirilir ve bu füzyon proteini (MS2-p65-HSF1), MS2 aptamerleri ile etkileşime girer. Bu şekilde daha yüksek bir gen aktivasyonu sağlanmış olur. Eksozomlar, 20-200 nm arasında değişen ve biyolojik sıvılardan izole edilebilen hücre dışı veziküllerdir. Eksozomlar mRNA, uzun kodlamayan RNA, mikroRNA'lar, proteinler ve lipitler içerirler. Eksozomlar, hücreler arası iletişimde, hücrelerin gen ve protein ekspresyon sinyallerini iletmede önemli bir rol oynarlar. Bu çalışmanın amacı, dCas9 ile genomu düzenlenmiş MSC'leri sisplatine reve eksozomlarını üreterek ve bu hücrelerin daha dirençli veya kemoterapötik, sisplatin olup olmadığını test etmektir. Bu çalışmanın amacı CRISPR/ dCas9 genom düzenleme aracı ile MSC hücrelerini sisplatine karşı dirençli hale getirmek ve ardından bu hücreleri ve bu hücrelerden elde edilmiş eksozomları kemoterapiye bağlı yumurtalık hasarını korumaya yönelik kullanmaktır.SAM aktivatör sistemi kullanılırak CD99 geni aktive edildi sisplatine karişı dirençli mezenkimal kök hücreler elde edildi. Ardından normal ve dirençli mezenkimal kök hücrelerden ayrı ayrı eksozomlar izole edildi. Daha sonra bu hücrelerden sferoidler elde edildi.“Transwell”kültür tabaklarının alt kısmında deneysel tedavi grupları ve üst kısmında(insert) hGRC1 (insan granuloza hücre dizisi) hücreleri kullanılarak ko-kültürler oluşturuldu. Ko-kültürler oluşturulduktan sonra hücreler sisplatine maruz bırakıldı. hGRC1 hücreleri sırasıyla 24, 48, 72 ve 96 saat sonra toplandı. İlk olarak, toplanan hücreler de canlılık testi yapıldı. Daha sonra qPCR ile inflamasyon ve apoptoz belirteçleri olan IL-10, IL-1Ra, Bax ve Bcl-2 genlerinin ifadeleri analiz edildi. Sonuç olarak, tüm deney gruplarında kontrol grubuna göre daha fazla canlı hücre olduğu, her saat grubunda inflamatuar ve apoptoz değerlerinin düştüğü gözlemlendi. Ayrıca dirençli hücrelerin, dirençli olmayan hücrelere göre daha etkili bir koruma sağladığı görüldü. Diğer deney gruplarına göre önemli ölçüde daha fazla koruma sağlayan grup, dirençli mezenkimal kök hücreleri ve bu hücrelerden izole edilen eksozomların birlikte kullanıldığı grup olmuştur. Bu sonuçlar sisplatin gibi kemoterapötiklerle dirençli hale getirilmiş mezenkimal kök hücrelerin ve onların eksozomlarının kullanımının granuloza hücrelerini koruyabileceğini göstermesi açısından önemlidir.

Özet (Çeviri)

Chemotherapy-induced ovarian failure (COF) can cause ovarian dysfunction diseases in which the ovaries temporarily or permanently stop functioning due to chemotherapy. Low estrogen serum levels and amenorrhea are infertility signs may contribute the clinical appearance of COF. Cisplatin is a platinum-based anticancer chemotherapeutic drug that has a gonadotoxic effect on all ovarian cells. Stem cells, especially mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from different adult tissues, have been tried as an adjunct therapy for COF. CRISPR genome editing technology is the most broadly used gene editing system, and dCas9 (dead Cas9) is a targeted CRISPR activation tool that lacks the nuclease effect. A synergistic activation mediator (SAM) is a type of CRISPR/dCas9 activation system composed of the dCas9-VP64 fusion protein integrated with a modified sgRNA, including two MS2 aptamers. MS2 binding protein is fused with two other activator domains, p65 and HSF1, and this fusion protein (MS2-p65-HSF1) interacts with MS2 aptamers. Exosomes are extracellular vesicles that range between 20–200 nm and can be isolated from biological fluids. They contain mRNA, long non-coding RNA, microRNAs, proteins, and lipids. Exosomes play an essential role in intercellular communication, in delivering gene and protein expression signals of cells. The aim of this research is to produce dCas9 genome edited MSCs and their exosomes and to test whether these cells are more resistant or chemotherapeutic, cisplatin, or not. Cisplatin-resistant mesenchymal stem cells were obtained by activating the CD99 gene with the SAM activator system. Then, exosomes were obtained from normal and resistant mesenchymal stem cells separately. Later, spheroids were formed with these cells. Co-cultures of MSCs were established with the experimental treatment groups at with hGRC1 (human granulosa cell line) cells in the insert using the Transwell aid. After the co-cultures were established, the cells were exposed to cisplatin. After that, hGRC1 cells were harvested at 24, 48, 72, and 96 hours, respectively. Firstly, a cell viability assay was performed on the collected cells. Then, by qPCR the expression of inflammatory or apoptotic markers as IL-10, IL-1Ra, Bax, and Bcl-2 genes was analyzed. As a result, it was observed that there were more viable cells in all experimental groups compared to the control group, and inflammatory and apoptosis values decreased in each hour group. And it was also discovered that resistant cells have provided a more effective protection than the non-resistant cells. The group that provides the most significant protection compared to all other experimental groups is the group that uses resistant mesenchymal stem cells and exosomes isolated from these cells, and this finding is important as it can be interpreted that the use of resistant mesenchymal cells with their exosomes can be an alternative adjunct therapy to protect ovarian granulosa cells during the use of cisplatin like chemotherapeutics for cancer.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    852513

    The use of CRISPR/dCas9 engineered mscs and exosomes to prevent cisplatin-induced ovarian failure in mice

    Farede sisplatin ile indüklenen ovaryen yetmezliği önlemek için CRISPR/dCas9 ile tasarlanmış mezenkimal kök hücrelerin ve eksozomlarının kullanımı

    ARİANA SİVASLIOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Üreme Biyolojisi Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU

  2. Tez No

    752506

    Application of CRISPR /DCAS9 systems for increasing theexpression of FSH receptor in human granulosa cells

    Insan granüloza hücrelerinde FSH reseptörünün ekspresyonunu arttırmak için CRISPR /DCAS-9 sistemlerinin uygulanmasi

    AYLİN SEREN GÜLLER

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyolojiKoç Üniversitesi

    Üreme Biyolojisi Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ SERÇİN KARAHÜSEYİNOĞLU

  3. Tez No

    459449

    Implementation of CRISPR based technologies for genome and gene expression manipulation of IRF4 in melanoma cells

    CRISPR temelli teknolojilerin melanoma hücrelerinde IRF4'ün gen ve genom ifadesinin manipülasyonu amacıyla uygulanması

    CANSU YERİNDE

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    BiyomühendislikBoğaziçi Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. NEŞET CEVDET TOLGA EMRE

  4. Tez No

    478687

    Mapping intracellular immune responses against lentiviral vectors in natural killer cells using genome scale CRISPR knockout

    CRISPR genom susturma kütüphaneleri ile NK hücrelerde antiviral sinyal yolaklarının tespit edilmesi

    AYDAN SARAÇ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Allerji ve İmmünolojiSabancı Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. DR. TOLGA SÜTLÜ

    DR. ABDULLAH KARADAĞ

  5. Tez No

    418841

    Generation of a CRISPR/Cas based genome editing system for MEFV gene in familial mediterranean fever-specific induced pluripotent stem cells

    Ailesel Akdeniz ateşine özgü uyarılmış pluripotent kök hücrelerdeki MEFV geni için CRISPR/Cas temelli genom yazılım sisteminin oluşturulması

    GÜLNİHAL KAVAKLIOĞLU

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2016

    GenetikKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    YRD. DOÇ. TEVFİK TAMER ÖNDER

Geri Dön