CRISPR-based synthetic translational regulation using non-conventional yeast
CRISPR tabanlı sentetik translasyonel regülasyonun konvansiyonel olmayan maya kullanılarak gerçekleştirilmesi
- Tez No: 982176
- Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İhsan Doğramacı Bilkent Üniversitesi
- Enstitü: Mühendislik ve Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Malzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: Belirtilmemiş.
Özet
Verimli ve programlanabilir gen ekspresyon sistemleri, Pichia pastoris gibi model olmayan maya konakçılarında rekombinant protein üretiminin iyileştirilmesi için kritik öneme sahiptir. Bu tez kapsamında, P. pastoris'te rasyonel olarak tasarlanmış GAP promotorları ile CRISPR/dCas9 tabanlı transkripsiyonel aktivasyon modüllerinin entegrasyonu yoluyla sentetik bir gen düzenleme platformu kurulmuştur. Bu çalışmanın temel amacı, doğal olarak konstitutif ifade gösteren GAP promotorunu, gRNA aracılığıyla efektör bölgelerin yönlendirilmesiyle hem aktivasyon hem de represyon yapılabilecek şekilde ayarlanabilir bir yapıya dönüştürmektir. Böylece, ortogonal ve bağlama-özgü kontrol sağlanması hedeflenmiştir. Bu amaçla, GAP promotorunun çekirdek işlevini bozmadan yeni gRNA bağlanma bölgeleri oluşturmak üzere iki farklı sentetik versiyon (versiyon 1 ve versiyon 2) rasyonel mutasyonlarla tasarlanmıştır. Bu promotorlar, eGFP raporlayıcı geninin önüne klonlanarak P. pastoris genomuna entegre edilmiştir. Glukoz, gliserol, etanol ve metanol gibi çeşitli karbon kaynakları altında yapılan koloni taraması sonucunda, çoğu mutant promotorun doğal tip PGAP promotoru ile karşılaştırılabilir düzeyde ekspresyon sağladığı gözlenmiştir. Bazı kolonilerde ise yüksek eGFP üretimi gözlenmiş ve bu durum, qPCR analizi ile doğrulanan çoklu gen kopya sayısına bağlanmıştır. Bu nedenle, deneylerin sağlıklı yorumlanabilmesi için tek kopya taşıyan koloniler seçilerek sonraki aşamalarda kullanılmıştır. Ardından, dCas9, MS2-bağlayıcı scaffold RNA'ları ve VP64 aktivasyon domenini içeren CRISPRa sistemi, seçilmiş tek kopya taşıyan kolonilere aktarılmıştır. Her promotor versiyonuna yönelik beşer adet olmak üzere toplam on özel tasarlanmış gRNA, dört farklı karbon kaynağı altında test edilmiştir. Özellikle versiyon 1, belirli gRNA'larla, en dikkat çekici olarak da v1-g2-c1 ile, tüm koşullarda anlamlı düzeyde eGFP aktivasyonu sağlamıştır. Buna karşın, versiyon 2 ile anlamlı bir aktivasyon elde edilememiş; bu durum, muhtemelen bağlanma bölgesinin konumu ya da promotor dizisindeki inhibe edici mutasyonlara bağlanmıştır. Bu çalışma, P. pastoris'te sentetik promotorlar üzerinde CRISPRa bileşenleri kullanılarak dinamik kontrol sağlayan modüler ve ortogonal bir transkripsiyonel düzenleme sistemini tanıtmaktadır. Sunulan yaklaşım, geleneksel indüklenebilir promotorlara alternatif olarak, gelecekteki metabolik mühendislik stratejileri ve endüstriyel rekombinant protein üretim uygulamaları için özelleştirilebilir ve kontrol edilebilir gen ekspresyon sistemlerinin geliştirilmesine zemin hazırlamaktadır.
Özet (Çeviri)
Efficient and programmable gene expression systems are essential for improving recombinant protein production in non-conventional yeast hosts such as Pichia pastoris. In this thesis, a synthetic gene regulation platform was established in P. pastoris by integrating rationally engineered GAP promoters with CRISPR/dCas9-based transcriptional activation modules. The aim was to convert the native constitutive GAP promoter into a tunable element capable of both activation and repression through gRNA-guided recruitment of effector domains, thus paving the way for orthogonal and context-specific control of gene expression. Two synthetic promoter variants (version 1 and version 2) were designed by introducing targeted mutations to create novel gRNA binding sites without disrupting core promoter function. These promoters were cloned upstream of an eGFP reporter and integrated into the genome of P. pastoris. Colony screening under various carbon sources (glucose, glycerol, ethanol, and methanol) revealed that most mutant promoters retained expression levels comparable to the wild-type PGAP, while certain clones displayed elevated eGFP production due to multiple gene integrations. Quantitative PCR analysis was employed to identify single-copy integrants for further use. Subsequently, a CRISPRa system comprising dCas9, MS2-binding scaffold RNAs, and the VP64 activation domain was introduced into selected single-copy clones. Ten custom-designed gRNAs (five for each promoter version) were tested under four carbon conditions to assess their activation potential. Notably, version 1 demonstrated robust transcriptional activation with specific gRNAs, especially v1-g2-c1, which significantly enhanced eGFP expression across all tested conditions. In contrast, version 2 failed to elicit notable activation, possibly due to unfavorable gRNA positioning or inhibitory mutations within the promoter sequence. This work introduces a modular and orthogonal transcriptional regulation system in P. pastoris, offering dynamic control over synthetic promoters using CRISPRa components. The approach establishes a foundation for future metabolic engineering strategies and recombinant protein expression systems that are independent of traditional inducible promoters and adaptable to various industrial contexts.
Benzer Tezler
- Farklı mof esaslı ilaç taşıyıcı sistemlerin sentezi, karakterizasyonu ve anti kanser etkinliğinin incelenmesi
Synthesis, characterization, and investigation of the anticancer activity of different mof-based drug delivery systems
MAHSA HEIDARNEJAD
- Improvement of Bacilysin biosynthesis in Bacillus subtilisPY79 VIA CRISPR/CAS9 technology
Bacillus subtilis PY79 suşunda basilisin biyosentezinin CRISPR/CAS9 teknolojisi ile iyileştirilmesi
HADEEL WALEED ABDULMALEK
Doktora
İngilizce
2023
Biyoteknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
PROF. DR. AYTEN KARATAŞ
- Engineering CRISPR-based DNA transversion editing technologies
CRISPR-temelli DNA transversiyon editleme teknolojilerinin mühendisliği
İBRAHİM ÇAĞRI KURT
Doktora
İngilizce
2021
BiyoteknolojiHarvard UnıversıtyBiyolojik Bilimler Ana Bilim Dalı
DR. J. KEITH JOUNG
- Memelilere ait rag endonükleazlarının saccharomyces cerevisiae'de sentetik biyoloji yaklaşımıyla inşası
Synthetic biology-based construction of mammalian rag endonucleases in saccharomyces cerevisiae
NUR EDA ÇUR
Yüksek Lisans
Türkçe
2026
BiyolojiBingöl ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MUSA TARTIK
- Engineering of probiotic Saccharomyces boulardii as a host for living therapeutic applications
Probiyotik Saccharomyces boulardii'nin yaşayan terapötik uygulamalarında konak olarak kullanılmak üzere geliştirilmesi
ORHAN NEDİM KURT
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
Mikrobiyolojiİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMalzeme Bilimi ve Nanoteknoloji Ana Bilim Dalı (disiplinlerarası)
DOÇ. DR. URARTU ÖZGÜR ŞAFAK ŞEKER