In silico and in vitro analysis of CLOCK gene SNPs from 1000 genome project
1000 genom projesinde yer alan CLOCK geni tek nükleotid polimorfizmlerinin in silico ve in vitro analizleri
- Tez No: 768391
- Danışmanlar: PROF. DR. İBRAHİM HALİL KAVAKLI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve Kontrol, Biyokimya, Biyoteknoloji, Computer Engineering and Computer Science and Control, Biochemistry, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Hesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 71
Özet
Sirkadiyen ritim, organizmalarda ~24 saatlik fizyolojik ve davranışsal süreçleri düzenleyen içsel bir süreçtir. Memelilerde sirkadiyen ritim, çekirdek saat proteinleri arasındaki etkileşimin bir sonucu olarak transkripsiyon ve translasyonel geri besleme döngüsü (TTFL) mekanizması tarafından üretilir. TTFL'de, CLOCK ve BMAL1 birbirleriyle etkileşime girer ve Period (Per) ve Cryptochrome (Cry) dahil olmak üzere saat kontrollü genlerin transkripsiyonunu başlatmak için promotör bölgesindeki E-box dizilerini bağlamak için bir heterodimer oluşturur. Zaman içinde, CRY'ler ve PER'ler sitozolde birikir ve daha sonra Casein kinase Iε ile çekirdeğe girer ve BMAL1: CLOCK temelli transkripsiyonu baskılar. Sirkadiyen ritmi kontrol eden başka yardımcı TTFL'ler de vardır. Genetik ve epidemiyolojik çalışmalar, sirkadiyen ritmini bozan faktörlerin obezite, diyabet, kardiyovasküler hastalıklar, yaşlanma, kanser, duygudurum ve uyku bozuklukları gibi çeşitli hastalıklara doğrudan neden olabileceğini düşündürmektedir. Çekirdek saat genleri için birkaç tek nükleotid polimorfizmi (SNP) tanımlanmış ve farklı hastalık türleri ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bununla birlikte, bu SNP'lerin hastalığın farklı tipine nasıl neden olduğu tam olarak tanımlanmamıştır. Bu yaklaşımlardaki zorluklardan biri, genom çapında ilişki dizileri (GWAS) çalışmalarının fonksiyonel tahminde sınırlamalara sahip olmasıdır. Bu sorunu çözmek için, belirli missense mutasyonlarının CLOCK proteininin ve dolayısı ile sirkadiyen ritim üzerindeki etkisini göstermek adına, 1000 Genom Projesinde yer alan CLOCK SNP'lerini fonksiyonel olarak tanımlamak ve karakterize etmek için in vitro tekniklerini izleyen in-siliko çalışmaları kullandım. Bu tür sistematik yaklaşımlar, patolojik etkileri olan SNP'leri keşfetmemize ve bu SNP'lerin proteinlerin işlevini nasıl etkilediğini anlamamıza olanak sağlayacaktır.Bu tezde, Ensembl veri tabanından tanımlanan nadir CLOCK missense varyasyonlarının (p.Phe104Cys, p.Leu118Arg, p. Asp119Val, p.Gly120Val ve p.Phe121Cys) fonksiyonel açıdan karakterizasyonlarını gerçekleştirdim. Başlangıçta bu varyasyonları hesaplama araçlarını kullanarak analiz ettim. Sonuçlar, varyantların CLOCK'un işlevsel olarak önemli bölgesinde yer aldığını ortaya koydu. In vitro deneysel yaklaşımı kullandım ve p.Leu118Arg, p.Asp119Val ve p.Phe121Cys CLOCK'un işlem etkinliğini azalttığını, p.Gly120Val CLOCK'un BMAL1 ile birlikte işlemi artırdığını gösterdim. Ancak, p.Phe104Cys CLOCK, karşılaştırılabilir transkripsiyonel aktiviteye sebep olmadı. CLOCK SNP'leri ve BMAL1 arasındaki afinite etkisini göstermek için, aralarında ortak immünopresipitasyon deneyi yaptım. Sonuçlar şunu gösterdi ki p.Leu118Arg, s. Asp119Val, p.Gly120Val CLOCK'lar BMAL1'e afiniteyi azaltmıştı ve ilginç bir şekilde p.Phe121Cys CLOCK, BMAL1'e afiniteyi artırmıştı. Daha geniş bilgi elde etmek için, CRY1'in p.Leu118Arg ve p.Phe121Cys CLOCK'larda baskılayıcı aktiviteyi azalttığını da gösterdim. Bu arada, MD simülasyonlarının tahmini bağlama enerjisi analizi biyokimyasal sonuçları destekledi ve bu tür SNP'lerin etkilerinin mekanizmasını incelemek için amino asid başına bağlanma enerjisi analizi kullanıldı. Toplu olarak, CLOCK'taki tek nükleotid değişikliklerinin bile CLOCK işlevlerini doğrudan etkilediğini keşfettim. Bu nedenle, CLOCK SNP'lerinin etkilerinin aydınlatılması, CLOCK'un sirkadiyen saat mekanizmasındaki yapı-işlevi için değerli bilgiler sağlayacak, daha ileri çalışmalar da saat bozulması ile ilgili hastalıklar yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesine de yardımcı olacaktır.
Özet (Çeviri)
Circadian rhythm is an internal process regulating ~24-h physiological and behavioral processes in organisms. In mammals, circadian rhythm is generated by transcription and translational feedback loop (TTFL) mechanism as a result of the interaction between core clock proteins. In TTFL, CLOCK and BMAL1 interact with each other and form a heterodimer to bind E-box sequences within the promoter region to initiate the transcription of the clock-controlled genes, including Period (Per) and Cryptochrome (Cry). Within the time, CRYs and PERs accumulate in the cytosol and then translocate into the nucleus with Casein Kinase Iε and repress BMAL1: CLOCK driven transcription. There are other auxiliary TTFLs exist that control circadian rhythm. Genetics and epidemiolocal studies suggest factors that disturb circadian rhythm result in susceptibility or may directly cause several diseases such as obesity, diabetes, cardiovascular diseases, aging, cancer, mood, and sleep disorders. Several single nucleotide polymorphisms (SNPs) for core clock genes have been identified and shown to be associated with different types of diseases. However, whether these SNPs contribute to the different type of the disease are ill-defined. One of the challenges in these approaches is that genome-wide association sequences (GWAS) studies have limitations in functional prediction. To address that, I developed using in vitro studies following the in-silico techniques to identify and characterize functional CLOCK SNPs from 1000 Genomes Ensemble to show the effect of a particular missense mutation on CLOCK protein on function. Such systematic approaches would allow us to discover SNPs with pathological effects and understand how these SNPs affect proteins' function. In this thesis, I performed a functional characterization of rare CLOCK missense variations (p.Phe104Cys, p.Leu118Arg, p.Asp119Val, p.Gly120Val, and p.Phe121Cys) identified from the Ensembl database. I initially analyzed these variations using computational tools. Results revealed that variants are located on the functionally important region of CLOCK. I used in vitro experimental approach and showed p.Leu118Arg, p.Asp119Val, and p.Phe121Cys CLOCK had reduced transactivation activity while p.Gly120Val CLOCK had increased transactivation along with BMAL1. However, p.Phe104Cys CLOCK had not been comparable transcriptional activity. To attrubitue these functional difference on the affinity between CLOCK SNPs and BMAL1, I performed co-immunoprecipitation between them Results indicated that p.Leu118Arg, p. Asp119Val, p.Gly120Val CLOCKs had reduced affinity to BMAL1and interestingly p.Phe121Cys CLOCK had increased the affinity to BMAL1. To gain more insight I further showed that the CRY1 had reduced repressor activity on p.Leu118Arg and p.Phe121Cys CLOCKs. Meanwhile, the estimation binding energy analysis of MD simulations supported the biochemical results, and binding energy analysis per residues was used to examine the mechanism of such SNPs effects. Collectively, I discovered that even single nucleotide changes in CLOCK directly affect the CLOCK functions. Hence, illumination of the effects of CLOCK SNPs would also help develop novel treatment strategies for diseases related to clock disruption for further studies and provide valuable information for the structure-function of CLOCK in circadian clock mechanism.
Benzer Tezler
- A study on RNA and protein effectors of transcription factor activity and gene expression
Transkripsiyon faktörü aktivitesi ve gen ifadesinde RNA ve protein etkenleri üzerine bir çalışma
AYŞE DERYA CAVGA
Doktora
İngilizce
2019
BiyofizikKoç ÜniversitesiKimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEHRA ÖZLEM KESKİN ÖZKAYA
PROF. DR. ATTİLA GÜRSOY
- In vitro characterization of CLOCK-interacting small molecules that changes the phase of the circadian rhythm
Sikradyen ritmin fazını değiştiren CLOCK ile etkileşime geçen küçük moleküllerin ın-vitro karakerizasyonu
BEGÜM BAYBALI
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyokimyaKoç ÜniversitesiKimya ve Biyoloji Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. İBRAHİM HALİL KAVAKLI
- Bilgisayar-destekli antikolinesteraz flavonoid türevlerinin sentezi ve intraoperatif kanser görüntüleme özelliklerinin incelenmesi
Synthesis of anticholinesterase flavonoid derivatives with computer aided drug discovery procedures and investigation of their intraoperative cancer imaging properties
BURCU BÜTÜN
Doktora
Türkçe
2017
Kimyaİstanbul Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK
PROF. DR. GÜLAÇTI TOPÇU
- Isıl işlem uygulamalarının biyoaktif anne sütü proteinleri üzerine etkisinin in silico ve in vitro olarak incelenmesi
In silico and in vitro analysis of heat treatment applications effects on bioactive human milk proteins
FERHAN YAPAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyofizikAnkara ÜniversitesiTemel Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ MEHMET ALTAY ÜNAL
- Amyotrofik lateral skleroz (ALS) hastalarında mitokondriyal fonksiyon bozukluğu ile ilgili genleri hedef alan mirna'ların in siliko ve in vitro yöntemlerle araştırılması
In silico and in vitro analysis of mirnas that target genes associated with mitochondrial dysfunction in patients with amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
GÜLÇİN BAYKAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2023
BiyolojiYıldız Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ ŞENAY VURAL KORKUT