Immunoreceptors modulate eosinophilic functions in viral immunity
Eozinofillerde viral bağışıklık yanıtının oluşumunda hücre zarına bağlı ve hücre içi reseptörlerin rollerinin araştırılması
- Tez No: 770757
- Danışmanlar: DOÇ. DR. CEREN ÇIRACI
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Allerji ve İmmünoloji, Biyoloji, Genetik, Allergy and Immunology, Biology, Genetics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2022
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 101
Özet
Bağışıklık bir terim olarak patojenlere karşı direnç anlamında kullanılır. Ayrıca vücudun tümörler, zararsız çevresel maddeler ve hatta bazen konak bileşenleri gibi bulaşıcı olmayan bileşiklere verdiği tepkileri ifade eder, bunlara sırasıyla tümör bağışıklığı, alerji ve otoimmünite denir. Bu bağışıklığı oluşturan hücreler, dokular ve moleküller gibi bileşenlerin tamamı bağışıklık sistemi olarak bilinir. Bu bileşenlerin yabancı moleküllere ve diğer maddelere karşı koordine ettiği yanıt ise bağışıklık yanıtını oluşturur. Enfeksiyonlara karşı koruma sağlamak veya enfeksiyöz bileşiklerin vücuttan yok edilmesini sağlamak, bağışıklık sisteminin temel fizyolojik işlevidir. Bunun yanında, kanser hücrelerine karşı immün reaksiyonları uyararak bazı tümör ve kanserlerin büyümesi engellenebilir. Patojenlere karşı insan savunma sistemi 3 seviyeye ayrılabilir: fiziksel ve kimyasal bariyerler, doğuştan gelen bağışıklık ve kazanılmış bağışıklık. Doğuştan gelen bağışıklık, vücudu istila eden patojenleri tespit etmek için sınırlı sayıdaki reseptöre dayanır. Bu sınırlı sayıdaki reseptörler, korunmuş mikrobiyal bileşenleri tanıyarak büyük patojen gruplarını hedeflerler. Ayrıca, kazanılmış bağışıklık tepkisinin aktivasyonu, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ile sağlanır. Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin hem hematopoietik hem de hematopoietik olmayan kökeni, onları T ve B lenfositlerini içeren kazanılmış bağışıklıktan farklı kılmaktadır. Doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin ilk unsuru, monositler, makrofajlar, mast hücreleri, dendritik hücreler, doğal öldürücü hücreler, doğal öldürücü T hücreleri, bazofiller, nötrofiller ve eozinofillerden oluşan hematopoietik hücrelerdir. Ayrıca, solunum, genitoüriner ve gastrointestinal kanalda bulunan deri ve epitel hücreleri, doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin bir başka unsurudur. Doğal bağışıklık, patojenik yapıları tanımlayan sınırlı sayıda ve genetik olarak önceden belirlenmiş reseptörlere bağlıdır. Toplu olarak kalıp tanıma reseptörleri (PRR'ler) olarak adlandırılan bu reseptörler ve PRR'ler tarafından tanınan mikrobiyal bileşenler, patojen ilişkili moleküler kalıplar (PAMP'ler) ve tehlike ilişkili moleküler kalıplar (DAMP'ler) olarak adlandırılır. PRR'ler, hücresel ve ayrıca endozomal membranlar veya sitozol gibi çeşitli hücre altı bölmelerinde bulunabilir. Ayrıca, kan dolaşımı veya interstisyel sıvılar gibi hücre dışı ortamda bulunabilirler. Dört ana tipe ayrılabilirler: 1) Toll benzeri reseptörler (TLR'ler), 2) NOD benzeri reseptörler (NLR'ler), 3) RIG-I benzeri reseptörler (RLR'ler), 4) C tipi lektin reseptörleri (CLR'ler). Doğuştan gelen bağışıklık hücrelerinin bu reseptörlerinin aktivasyonu, kazanılmış bağışıklık hücrelerinin uyarılmasıyla sonuçlanır. Bu nedenle, PRR'ler, enfeksiyöz ajanları yok etmek için bağışıklık tepkisi oluşturmaya yardımcı olur, örneğin, enfekte olmuş hücrelerin ölümünü indüklerler. İnsanlar, virüsler de dahil olmak üzere mikroorganizmaların sürekli olarak istilasıyla tehlike altındadır. İstilacı virüslerin saptanması ve bunlara karşı bağışıklık tepkisinin sağlanması viral enfeksiyonların sonucu için çok önemlidir. Viral nükleik asitleri tanımak, virüs enfeksiyonunu algılamanın ilk adımıdır. Bu tanıma esas olarak genetik olarak önceden belirlenmiş PRR'lere bağlıdır. TLR3, TLR7, TLR8 ve TLR9 gibi viral genetik materyali tanıyan TLR protein ailesi üyeleri vardır. Viral nükleik asitlerin veya proteinlerin PRR'ler tarafından tanınması üzerine, hem otokrin hem de parakrin şekillerde hedef hücrelerin aktivasyonu ile sonuçlanan tip I IFN üretimi indüklenir. TLR7 ve TLR8, çeşitli ssRNA virüslerinin varlığını tespit etme yeteneğine sahiptir. Bunlar arasında influenza, veziküler stomatit virüsü (VSV), HIV, Sendai virüsü (SV) ve bir dizi koronavirüs ve flavivirüs bulunur. TLR3, endozomlar üzerinde bulunan ve çift zincirli DNA tarafından aktive edilen bir endozomal nükleotid sensörüdür. Çift zincirli RNA birçok virüsün genomu olduğundan veya yaşam döngüleri boyunca çift zincirli RNA ürettikleri için TLR3 ayrıca tek zincirli RNA ve DNA virüslerinin varlığını da tespit eder. TLR'lerin aksine, RLR'ler sitozol içine yerleştirilmiş RNA dedektörleridir. RLR protein ailesi üç üye içerir. Bunlar RIG-I, MDA5 ve LGP2'dir. Viral RNA birleşmesi ve oligomerizasyonu üzerine, RLR'ler, CARD'ları aracılığıyla MAVS proteinine bağlanır. MAVS, bir adaptör protein olarak RLR sinyal iletiminde önemli bir role sahiptir. Ardından, MAVS, IRF3 ve IRF7'nin aktivasyonu ile sonuçlanan TBK1 ve IKKε'yi indükler. Bu transkripsiyon faktörü ve NF-κB birlikte tip 1 IFN'lerin üretimini aktive eder. Dahası, NLR'ler sitozolik doğuştan gelen bağışıklığın önemli bir parçasıdır ve inflamatuar, MAPK, NF-κB ve tip 1 IFN sinyali gibi çeşitli kritik yolaklarda rol oynar. İnflamasom aktivasyonu önemli bir kısımdır, çünkü IL1β ve IL18'in salgılanmasına öncülük ederek inflamasyonu indükler, bu da umarız ki virüs enfeksiyonunun ortadan kaldırılmasıyla sonuçlanır. Eozinofiller, akut ve kronik enfeksiyonlar, kanser ve tromboz gibi birçok patolojik süreçte tanımlanmış rolleri ile büyük ilgi görmektedir. Eozinofillerin paraziter enfeksiyonlardaki rolü kabul edilmekle birlikte, mantar, bakteriyel ve viral enfeksiyonlarda da rolü bilim dünyasında aktif bir konudur. Bu granülositler, RNazlar gibi antiviral fonksiyonlara sahip maddeler içerir ve üretirler ve ayrıca antijen sunma yetenekleri ile kazanılmış bağışıklıkta yer alırlar. Eozinofillerle ilgili bulgular, eozinofillerin daha fazla araştırılması gereken potansiyel antiviral rolleri olduğunu gösterir. Hayvan modelleri ve birincil insan eozinofilleri üzerinde yapılan araştırmalar, eozinofillerin viral enfeksiyonlara karşı değerini ortaya çıkarmasına rağmen, viral enfeksiyonlardan sonra eozinofilik fonksiyonların nasıl değiştiği sorusu hala belirsizdir. Bu nedenle çalışmamızın amacı, sırasıyla uygun ligandlar, poly(I:C), R848 ve ssRNA40 ile TLR3, TLR7/8 ve TLR8'in aktivasyonu sağlanarak eozinofilik fonksiyonlardaki değişiklikleri araştırmaktır. Öte yandan kandaki düşük eozinofil varlığı (%1-6) in vitro koşullarda çalışılmasını zorlaştırmaktadır. Bu nedenle, eozinofilik fonksiyonları incelemek için bir model hücre hattının oluşturulması gerekliydi, bu durumda bu model hücre hattı Eol-1 oldu. Çalışmamızda viral ligandlar ile muamele üzerine Eol-1 hücrelerinin aktivasyonunu belirlemek için eozinofilik PRR'ler ve immün reseptörler araştırıldı. İkinci olarak, eozinofilik fonksiyonları daha iyi anlamak için eozinofillerin yüzey belirteçleri belirlendi. Ayrıca, kazanılmış immüniteye olası katılımı araştırmak için saldıkları sitokinler değerlendirildi. Ayrıca, matris metalloproteinazların üretimi ölçüldü. Çalışmamızda TLR8 aktivasyonu üzerine IL-6 ve IFN- γ salgılanmasında önemli artış gözlemledik. Ayrıca, Eol-1 hücrelerinde eksprese edilen IL5Rα ve PDL1'in sayısı TLR3, TLR7/8 ve TLR8 indüksiyonları ile artmıştır. Verilerimiz TLR3, TLR7 ve TLR8 aktivasyonu üzerine eozinofillerde fonksiyonel artış yaşandığını gösterdikten sonra, viral enfeksiyonlar sırasında eozinofillerin granül içeriğindeki olası değişiklikleri araştırdık. Eol-1 hücrelerine ssRNA40 verilmesi üzerine artan ECP mRNA seviyesini gösterdik. Bu veriler aynı zamanda ECP'nin antiviral eozinofilik fonksiyonların düzenlenmesi üzerindeki olası rollerini de göstermektedir. MMP'ler, mikrobiyal enfeksiyonlar sırasında lökosit aktivasyonundan kemokin ve sitokin işlemeye kadar rolleri de olan matris parçalayıcı enzimlerdir. İmmün regülasyondaki işlevlerinin yanı sıra MMP'ler, patojen kalıcılığı veya yayılması ile sonuçlanabilecek doku yıkımına da yol açabilir. Öte yandan, CD147, çeşitli viral enfeksiyonlarda kritik rol oynayan bir matris metalloproteinaz indükleyicisidir. Son zamanlarda, CD147'nin şiddetli akut solunum sendromu koronavirüs 2'ye (SARS-CoV-2) alternatif bir reseptör olduğu ve böylece konak hücre istilasına yardımcı olduğu ortaya çıkmıştır. Bu sebeplerle, çalışmamızda, eozinofilik antiviral immün yanıttaki olası rollerini ortaya çıkarmak için MMP'leri ve MMP indükleyici CD147'yi de araştırdık. RT-qPCR'den elde edilen sonuçlar CD147 ve TLR aktivasyonu arasındaki ilişkiyi gösterdi ve ayrıca jelatin zimografiden elde edilen veriler, Eol-1 hücrelerinde MMP-9 ve TLR aktivasyonu arasındaki ilişkiyi açıkça göstermiştir. Test edilen tüm uyarıcıların, Eol-1 hücrelerinde mRNA düzeyinde CD147'yi artırdığı görülmüştür. Ayrıca 24 saat boyunca TLR3 ve TLR8 indüksiyonu Pro-MMP9 üretimini önemli ölçüde artırmıştır. Bu sonuçlardan sonra, özellikle TLR8'in aktivasyonu üzerine eozinofilik fonksiyonlardaki artış, bizi eosinofillerde TLR'lerin uyarılmasıyla indüklenen yolaklar üzerinde rol oynayabilecek olası adaptör proteinleri araştırmaya yöneltmiştir. CARD9, mantar, bakteriyel ve viral enfeksiyonlar dahil olmak üzere bağışıklık sisteminin farklı noktalarında yer alan çok işlevli bir adaptör proteindir. Bu nedenle, TLR3, TLR7/8 ve TLR8 indüksiyonları üzerine Eol-1 hücrelerinde CARD9 ekspresyonunu araştırdık. CARD9'un azalmış mRNA ekspresyonlarının yanı sıra, Eol-1 hücrelerinde protein düzeyinde CARD9 ekspresyonunda önemli bir artış olduğunu gördük. Ardından, CARD9'un eozinofillerde viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık tepkisi oluşturmak için bir etkileşim ortağı olup olmadığını araştırdık. Olası etkileşim ortağı olarak, ilk olarak, antiviral bağışıklığa iyi bilinen katılımı nedeniyle RIG-I seçildi. TLR8 agonisti (ssRNA40, 2 μg/ml) ile uyarılan hücrelerde sadece 1.49 kat artış gördük. Ardından, NOD2'yi CARD9'a olası ikinci etkileşim ortağı olarak seçtik. Araştırmalar, parainfluenza virüsü, VSV, RSV ve IAV gibi birçok RNA virüsü enfeksiyonunda NOD2'nin etkisini göstermektedir. Daha sonra, NOD2'nin TLR aktivasyonu yoluyla eozinofilik antiviral bağışıklıkta bir rolü olup olmadığını anlamak için araştırmamızda NOD2 araştırıldı. Protein ekspresyonu verileri, Eol-1 hücrelerinde TLR7/8 ve TLR8'in indüklenmesinden sonra NOD2 protein ekspresyonunda önemli artışlar gösterdi. Genel olarak, test ettiğimiz tüm uyaranlar arasında, ssRNA40, ECP ve CD147'nin mRNA ekspresyonlarını ve immün reseptörlerin, eozinofillerin yüzey belirteçlerinin ekspresyonunu ve sitokin salgılamalarını indüklemede en güçlü olanıydı. İlginç bir şekilde, mantar enfeksiyonlarına karşı kritik bir reseptör olan CARD9, TLR7/8 ligandları ile indüksiyondan sonra önemli ölçüde arttı, bu da eozinofiller tarafından oluşturulan antiviral immün yanıtta TLR3'ten ziyade TLR7 ve TLR8'in önemli bir rol oynadığını ortaya koydu. Bulgularımız, eozinofillerle ilişkili bulaşıcı hastalıklara odaklanan çalışmaların önünü açacaktır.
Özet (Çeviri)
Immunity a term used as resistance to pathogens, also referred to reactions of the body to noninfectious compounds such as tumors, harmless environmental substances and even sometimes host's components, each of which are called as tumor immunity, allergy and autoimmunity, respectively. The whole components like cells, tissues and molecules that generate this immunity is defined as the immune system and the immune response is coordinated by these components to foreign substances. Providing protection against infections or eradication of the infectious compounds from the body is the major physiological function of the immune system. Besides, growth of some tumors and cancers can be inhibited by stimulating immune reactions against cancer cells. The human defense system against pathogens can be divided into 3 levels: physical and chemical barriers, innate immunity and adaptive immunity. The innate immunity relies on a finite number of receptors for detecting the invading pathogens. These limited number of receptors target large groups of pathogens by recognizing conserved microbial patterns. Furthermore, activation of adaptive immune response is achieved by innate immune response. Innate immune cells include both hematopoietic and nonhematopoietic origin which make them different from adaptive immunity which relies on T and B lymphocytes. Innate immune response development involves hematopoietic cells that differentiate into monocytes, macrophages, mast cells, dendritic cells, natural killer cells, natural killer T cells, basophils, neutrophils and eosinophils. Moreover, hematopoietic cells include skin and epithelial cells reside in respiratory, genitourinary and gastrointestinal tracts. Innate immunity depends a few germline encodedreceptors which sense pathogen specific structural motifs. These receptors are collectively called pattern recognition receptors (PRRs) and microbial components recognized by PRRs are called pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and damage-associated molecular patterns (DAMPs). PRRs can exist in various cellular compartments like cell membrane and endosomal membranes, or cytosol. Moreover, they can be found in extracellular environment such as bloodstream or interstitial fluids. They are mainly divided into four major types: 1) Toll-like receptors (TLRs), 2) Nucleotide binding and oligomerization domain-like receptors (NLRs), 3) Retinoic acid-inducible gene 1-like receptors (RLRs), 4) C-type lectin receptors (CLRs). Activation of these receptors of the innate immune cells result with induction of adaptive immune cells. Hence, PRRs help to generate immune response to eradicate infectious agents, for example they induce the death of the infected cells. Humans are constantly under the threat ofinvasive opportunistic microorganisms including viruses, fungi, bacteria and parasites. The detection and development of an appropriate immune response against invading viruses are crucial for the outcome of virus infections. Recognizing viral nucleic acids is the first step for sensing virus infection. This recognition mainly depends on the genetically predetermined and germline encoded PRRs. There are TLR protein family members recognize viral genetic material such as TLR3, TLR7, TLR8 and TLR9. Upon recognition of viral nucleic acids or proteins by PRRs, production of type I IFN is induced resulting in the activation of target cells in both autocrine and paracrine manners. TLR7 and TLR8 have the ability to detect the existence of various single stranded RNA (ssRNA) viruses. These viruses include influenza, vesicular stomatitis virus (VSV), HIV, Sendai virus (SV) and a number of coronaviruses and flaviviruses. TLR3 is an endosomal nucleotide sensor which is located on endosomes and activated by double stranded RNA (dsRNA). As dsRNA is the genome for many viruses or they synthesize dsRNA during their life cycles, TLR3 also detects the existence of dsRNA and DNA viruses. Unlike TLRs, RLRs are RNA detectors locolized in the cytosol. RLR protein family includes three members: RIG-I, MDA5 and LGP2. Upon viral RNA association and oligomerization, RLRs bind to mitochondrial antiviral signaling protein (MAVS) through its CARD. MAVS has an essential role in RLR signal transduction as an adaptor protein whichinduces TBK1 and IKKε leading to the activation of IRF3 and IRF7. These transcription factors and NF-κB, together, activate the production of type 1 IFNs. Moreover, NLRs are important part of the cytosolic innate immunity and have a role in various key pathways such as inflammasome, MAPK, NF-κB and type 1 IFN signaling. Activation of inflammasome complexes is essential because it induces inflammation by leading to the production and secretion of IL1β and IL18 also known as inflammasome dependent cytokines. Eosinophils attract considerable attention with their identified roles in many pathological processes such as acute and chronic infections, cancer and thrombosis. Although their accepted roles in parasitic infections, involvement of eosinophils in fungal, bacterial and viral infections is an on-going research topic in the field of immunology. These granulocytes contain and generate substances with antiviral functions such as RNases and they may also involved in adaptive immunity with their potential antigen-presenting ability. Together, findings about eosinophils indicate potential antiviral role for eosinophils which need to be explored further. Despite the studies on animal models and primary human eosinophils demonstrating the importance of eosinophils against viral infections, the question of how eosinophilic functions are regulated following he viral infections is still ambiguous. Thus, the aim of the study is to investigate the changes in eosinophilic functions upon activation of TLR3, TLR7 and TLR8 with proper ligands, poly(I:C), R848, and ssRNA40, respectively. low number of eosinophils in blood (1-6%) makes them difficult to study in vitro. Therefore, we utilized EoL-1 human eosinophil line as a model in our study which was previously shown to serve an ideal model due to the expression of eosinophilic markers In this study we initially determined the activation of Eol-1 cells upon treatment with viral ligands, eosinophilic PRRs and immune receptors. Secondly, surface markers of eosinophils were determined to further understand the eosinophilic functions. Also, cytokines that they released were analyzed to understand the potential involvement in the induction of adaptive immunity. Moreover, production of matrix metalloproteinases was measured. We observed significant increase in IL-6 and IFN-γ secretion upon TLR8 activation. Also, the number of IL5Rα and PDL1 expressing Eol-1 cells were augmented with TLR3, TLR7/8 and TLR8 inductions. Our data suggested roles for TLR3, TLR7 and TLR8 in eosinophilic functions. We then investigated the changes in granule content of eosinophils during viral infections. We showed that ECP mRNA levels were upregulated upon the ssRNA40 treatment in Eol-1 cells. This data also, demonstrate the possible roles of ECP on the regulation of antiviral eosinophilic functions. MMPs are matrix-degrading enzymes which have roles in leukocyte recruitment to chemokines during microbial infections. In addition to their functions in immune regulation, MMPs can also lead to tissue damage as a result of persistant pathogen infections or spread. Furthermore, CD147 is a matrix metalloproteinase inducer that plays critical roles in various viral infections. Recently, CD147 was shown as an alternative receptor for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), Therefore, we also investigated the MMPs and MMP inducer CD147to better understand their roles in eosinophilic antiviral immune responses. The results from RT-qPCR showed a relationship between both CD147 and TLR activation as well as the data obtained from gelatin zymography clearly indicated the relationship between MMP-9 and TLR activation in Eol-1 cells. All stimulants tested in this study elevatedthe CD147 at mRNA level in Eol-1 cells. Additionally, TLR3 and TLR8 ligands significantly increased the Pro-MMP9 production at 24 hours post-induction in EoL-1 cells. Upregulation of TLR8 led us investigate the potential adaptor molecules which may have roles in downstream signaling pathways through TLRs in eosinophils. CARD9 is a multifunctional adaptor protein which participates in different phases of the immune system including fungal, bacterial and viral infections. Thus, we investigated the CARD9 expression in Eol-1 cells upon TLR3, TLR7/8 and TLR8 inductions. Despite the decreased mRNA expressions of CARD9, there was a significant increase in CARD9 expression at protein level in Eol-1 cells. Next, we measured the expression levels of cytosolic PRR RIG-I at protein level because of its well-known roles in antiviral immunity. We observed 1.49-fold increase in the cells stimulated with TLR8 agonist (ssRNA40, 2 μg/ml). Then, we measured NOD2 as it is already known as the interaction partner for CARD9. Numerous studies formerly showed the NOD2 involvement in response to many RNA virus infections such as parainfluenza virus, VSV, RSV and IAV. Here we showed that NOD2 protein expression was significantly increased after induction with TLR7/8 and TLR8 ligands in Eol-1 cells. Overall, of all the stimuli we tested, ssRNA40 (TLR8 signaling) was the most potent in inducing the mRNA expressions of ECP and CD147, and protein expression of immune receptors, surface markers of eosinophils and cytokines. Interestingly, CARD9 which is a critical adaptor against fungi infections was significantly increased after induction with TLR7/8 ligands, suggesting an important role for TLR7 and TLR8 rather than TLR3 in antiviral immune response generated by eosinophils. Our findings will pave the way for future studies focusing on eosinophil related infectious diseases.