Deglikolize kolisin M ve K formlarının bitkide ın vıvoüretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve doğal gıda katkı maddesi olarak kullanım olanakları
In vivo production, purification, characterization ofdeglycolysed colicine M and K forms in plant and usage asnatural food additives
- Tez No: 798359
- Danışmanlar: PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Mikrobiyoloji, Biotechnology, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 121
Özet
Günümüzde gıdalarda yaygın olarak bulunan bakteriyel patojenlere karşı artan direnç, küresel halk sağlığı ve gıda güvenliği için kritik bir tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca tüketicilerin kimyasal katkı maddesi içermeyen doğal gıdalara olan talebinin artması bilim insanlarını alternatif gıda koruyucuları bulmaya yöneltmiştir. Kolisinler, belirli Escherichia coli (E. coli) suşları tarafından üretilen, konakçı olmayan E. coli suşlarını öldüren ve diğer bakteri suşları ile rekabeti azaltmak için çevreye salınan antimikrobiyal proteinlerdir. Kolisin-M, dış hücre zarını tahrip ederek yakından ilişkili diğer bakteri suşlarına etki eden bu grubun bir üyesidir ve FDA tarafından güvenli (GRAS) olarak kabul edilmiştir, bu nedenle güçlü bir antimikrobiyal madde olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Kolisin M (CM), geçici ekspresyon sistemi kullanılarak bitkilerde rekombinant olarak eksprese edilmiş ve antimikrobiyal aktivitesi gösterilmiştir. Bakteriyel protein olarak kolisin M, doğal konakçılarda glikozile edilmez ve bu nedenle bitkiler dahil herhangi bir ökaryotik sistemde anormal şekilde glikozile edilir. Bakteriyel Endo H deglikozilasyon enzimi ile ortak ifade yoluyla hedef proteinleri glikozile edilmemiş bitkiler de dahil olmak üzere ökaryotik sistemde proteinler üretmek için sağlam bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu teknoloji, şarbona, sıtmaya, Covid-19'a, kuduza karşı aşı üretmek ve bazı terapötikler için başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmanın amacı, Nicotiana benthamiana (N. benthamiana)'da N-glikozile edilmemiş, doğal benzeri formda Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak rekombinant Kolisin-M üretmektir. Bu çalışmada, enzimatik Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak, N. benthamiana bitkisinde hem glikozile edilmiş (gCM) hem de-glikozile edilmiş (dCM) formda rekombinant kolisin M ürettik ve bunların antimikrobiyal aktivitesi ve stabilitesi karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Kolektif bulgularımız, dCM'nin glikozile edilmiş formuyla karşılaştırıldığında stabilitesinin ve aktivitesinin daha yüksek olduğunu gösterdi. Karşılaştırma için Kolisin K (CK), N. benthamiana'da hem Endo H ile hem de Endo H olmadan ifade yoluyla üretildi. CK'nin birkaç potansiyel N-glikozile edilmiş bölgesi olmasına rağmen, sonuçlarımız CK'nin N. benthamiana bitkisinde eksprese edildiğinde glikozile olmadığını doğruladı. Rekombinant bitki tarafından üretilen proteinler (hem Endo H ile ortak ifade ile hem de olmadan), Ni-kolon afinite kromatografisi kullanılarak kısmen saflaştırıldı ve stabilite ve aktivite açısından karakterize ettiğimiz kısmi saflaştırılmış CK proteinlerinde Endo H ile ifade edilen veya edilmeyen CK'ler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Tez çalışmasından elde edilen sonuçlar; bitkide üretimi gerçekleştirilen gCM ve dCM proteinlerinin SDS-PAGE ve Western-Blot analizine göre, moleküler kütleleri sırasıyla ~29 ve 26 kDa olarak bulunmuştur. Hem gCM hem de dCM'nin stabilite analizi, +4 °C, +25 °C ve +37 °C'de uzun süre (sırasıyla 4 ay, 12 gün ve 6 gün) incelenmiş ve dCM, glikozile edilmiş muadilleriyle karşılaştırmada tüm sıcaklıklarda üstün stabilite göstermiştir. Bitkide üretilen CM proteinlerinin antimikrobiyal aktivite testleri, seçilen E. coli DH5α ve ATCC 25322, Salmonella ATCC 17028 ve Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC25923 suşları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tüm aktivite testlerinde dCM proteini, glikozile edilmiş muadilinden daha aktif sonuçlar vermiştir. Sırasıyla aralarında, 3,8, 1,7, 4,4 ve 2,4 katlık bir oran çıkmıştır. Ek olarak, dCM'nin ekspresyon seviyesi ve saflaştırma verimi, glikozile edilmiş muadili ile karşılaştırıldığında 2 kat daha yüksek çıkmıştır. Sonuç olarak, sonuçlarımız, deglikozile edilmiş Endo H teknolojisinin, glikozile edilmemiş diğer kolisinleri, doğal benzeri formlarında üretmek için kullanılabileceğini göstermektedir; bu, bu kolisinlerin bir gıda katkı maddesi olarak ticarileşme potansiyelini artırmak için önemli olacaktır
Özet (Çeviri)
Today, increasing resistance of bacterial pathogens common in food poses a critical threat to global public health and food security. In addition, the increase in consumers' demand for natural food without chemical additives has led scientists to find alternative food preservatives. Colicins are antimicrobial proteins produced by certain strains of Escherichia coli (E. coli), which kill non-host E. coli strains and are released into the environment to reduce competition with other bacterial strains. Colicin-M is one member of this group that acts on other closely related bacterial strains by destroying their outer cell membrane and is recognized as safe (GRAS) by the FDA, therefore, it has great potential as a potent antimicrobial agent. Colicin M has been recombinantly expressed in plants using the transient expression system and its antimicrobial activity was demonstrated. Colicin M as bacterial protein is not glycosylated in native hosts, and therefore, aberrantly glycosylated in any eukaryotic system including plants. A robust technology to produce proteins in eukaryotic system including plants in non-glycosylated, in their native-like form by co-expression target proteins with bacterial Endo H deglycosylation enzyme was developed. This technology has been successfully applied to produce vaccines against, malaria, Covid-19, rabies, and some therapeutics. The goal of this study is to produce recombinant ColicinM in Nicotiana benthamiana (N.benthamiana) in non-N-glycosylated, native-like form using Endo H deglycosylation technology. In this study, using enzymatic Endo H deglycosylation technology, we produced recombinant colicin M in the N. benthamiana plant in both glycosylated (gCM) and deglycosylated (dCM) forms, and their antimicrobial activity and stability were comparatively studied. Our collective findings demonstrated superipor stability and activity of dCM compare with that of glycosylated form. For comparison, Colicin K (CK) was also produced in N. benthamiana with or without Endo H by co-expression. Although, CK has several potential N-glycosylated sites, but our results confirmed that CK is not glycosylated when expresses in N. benthamiana plant. Both (with or without co-expression by Endo H) recombinant plant produced proteins were partially purified using Ni-column affinity chromatography and partial purified CK protein we characterized for stability and activity. No significant differences were observed between CKs, which were produced with or without coexpression with Endo H. In conclusion, our results demonstrate that the deglycosylated Endo H technology can be used to produce other colicins in non-glycosylated, in their native-like form, which would be important to increase the commercialization potential of these colicins as a food additive.
Benzer Tezler
- Characterization and redesign of a new laccase for industrial biotechnological applications
Endüstriyel biyoteknolojik uygulamalar için yeni bir lakkaz enziminin karakterizasyonu ve yeniden tasarlanması
AHMET TÜLEK
Doktora
İngilizce
2020
BiyokimyaGebze Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BARIŞ BİNAY
- Protein isolation and N- glycan characterization of different mushroom species by using PNGase F enzyme
Farklı mantar türlerinin protein izolasyonu ve PNGase F enzimi kullanılarak N- glikan karakterizasyonunun yapılması
TUBA ÇAĞIRTEKİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
BiyoteknolojiÇanakkale Onsekiz Mart ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SERCAN KARAV
- N. benthamiana bitkisinde aktif insan faktör IX rekombinant proteininin varyantlarının klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Cloning, expression, purification and characterization of factor IX variants in N. benthamiana plant
ILAHA MUSAYEVA
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyoteknolojiAkdeniz ÜniversitesiTarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV
- Cloning, expression, and characterization of the β-glucosidase from Jiangella ureilytice KC603
Cloning, expression, and characterization of the β-glucosidasefrom Jiangella ureilytica KC603
ARİFE KAÇIRAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
BiyoteknolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiMoleküler Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ALİ OSMAN BELDÜZ
- Design of short peptides targeting the interaction between SARS-CoV-2 and human ACE2
SARS-CoV-2 spike ve insan ACE2 arasındaki etkileşimi hedefleyen kısa peptitlerin tasarımı
NUMAN NUSRET USTA
Yüksek Lisans
İngilizce
2023
Bilim ve Teknolojiİstanbul Teknik ÜniversitesiHesaplamalı Bilimler ve Mühendislik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ SEFER BADAY