Geri Dön

Engineering, production, and characterization of glycosylated and deglycosylated forms of the Pfs25 vaccine candidate

Pfs25 aşi adayinin glikozile ve deglikozile formlarinin mühendisliği, üretimi ve karakterizasyonu

  1. Tez No: 953688
  2. Yazar: DAMLA YÜKSEL
  3. Danışmanlar: PROF. DR. NEDİM MUTLU
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2025
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Akdeniz Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 123

Özet

Sıtma, Plasmodium parazitlerinin neden olduğu sivrisinek kaynaklı ölümcül bir hastalıktır. Dünya çapındaki tüm çabalara rağmen sıtma, insan nüfusu için ölüm nedeni olmaya devam etmektedir. Günümüzde sıtmaya karşı birçok aşı geliştirme çalışması yürütülmektedir. Ancak yüksek koruma sağlayan bir aşı bulunmamaktadır. İncelenen aşılar, özellikle Pfs25, Pfs230, Pfs48/45 gibi bulaşmayı engelleyen (TB) cinsel evre antijenleri olmak üzere parazitik yaşam döngüsü hedefleri kullanılarak tasarlanmıştır. Pfs25 gibi bulaşmayı engelleyen aşı (TBV) adayları, sivrisinekteki parazitin döllenmesini ve olgunlaşmasını önler. Bulaşmayı engelleyen antijenler çoğunlukla maya ve bitkilerde üretilir. Son yıllarda, bitki ekspresyon sistemlerinin yüksek üretim kapasitesine sahip tam uzunluktaki işlevsel rekombinant proteinlerin güvenli, hızlı ve ucuz üretimi için umut verici bir sistem olduğu gösterilmiştir. Plasmodium parazitleri N-bağlı glikozilasyon mekanizmasından yoksundur ancak yapılarında glikozilasyon bölgeleri içerir. Ökaryotik konakçılarda üretildiklerinde anormal glikozilasyona uğrarlar ve bu düşük iletim engelleme aktivitesine neden olur. Bu sorunu çözmek için yakın zamanda PNGase F ve Endo H ile in vivo deglikozilasyon stratejileri geliştirilmiştir (Mamedov ve ark. 2012,2016,2017). Bu strateji, bir bitki ekspresyon sisteminde hedef proteinlerin, bakteriyel Endo H deglikozilasyon enzimiyle birlikte ekspresyonu yoluyla glikozile edilmemiş bir formda üretilmesini sağlamıştır. Bu stratejinin kullanımı, hedef proteinlerin doğal benzeri yapılarda üretilmesine olanak tanır. Bu teknoloji şarbon, sıtma, SARS-CoV-2 ve kuduza karşı aşıların üretiminde başarıyla uygulanmıştır. Pfs25, Plasmodium falciparum sivrisinek aşaması antijeni, iletim bloklayıcı aşısının için umut verici bir hedeftir. Sivrisinek aşamasında P. falciparum ookinete yüzeyinde ekspresyon gösterir. Pfs25, sistein açısından zengin bir protein olması ve çoklu disülfid bağları içermesi bakımından karmaşık bir proteindir. Bu karmaşık yapı nedeniyle, heterolog sistemlerde düzgün katlanmış Pfs25 proteini üretmek zor olmuştur. Ancak bu zorluklara rağmen, maya ve bitki geçici ifade sistemleri kullanılarak Pfs25 proteinlerinin üretimi başarılı olmuştur. Bu çalışmalarda, rekombinant Pfs25 proteini düşük iletim blokaj aktivitesi göstermiştir. Plasmodium parazit antijenleri, füzyon proteinleri, ve adjuvanlar ile konjugasyon yoluyla birlikte Pfs25 proteini üretilerek bu zayıf immunojenesite arttırılmaya çalışılmıştır. Tüm bu girişimlere rağmen, Pfs25 proteininin iletim blokaj aktivitesi artırılamamış ve herhangi bir ökaryotik ifade sisteminde deglikozile edilmiş formda üretilememiştir. Nicotiana benthamiana'da Pfs25'in deglikozile edilmiş formunun üretimi, iletim blokaj aktivitesi açısından çok önemlidir. Bu nedenle, bu tezde N. benthamiana'da P. falciparum sivrisinek evre antijeni Pfs25 proteinini N. benthamiana bitkisinde yüksek stabilite ve immünojenisiteye sahip hem glikozillenmiş hem de in vivo Endo H deglikozillenmiş bir formda üretmeyi amaçladık. Bu amaç doğrultusunda, Pfs25 proteini başarıyla klonlanmış ve hem glikozillenmiş hem de Endo H deglikozillenmiş formda N. benthamiana bitkisinde üretilmiştir. Bitkisel üretilen proteinler afinite kromatografisi ile saflaştırılmış, verim, stabilite ve immunojenesite açısından karakterize edilmiştir. Elde edilen bulgularımız, deglikolize Pfs25'in glikozile formuna kıyasla daha yüksek stabilite ve aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Bu çalışmanın bulguları, Pfs25 proteininin deglikosile edilmiş varyantının yüksek verim, immunojenesite ve transmisyon bloklama aktivitesi göstermesinin beklendiğini göstermiştir. Elde edilen sonuçlar göz önünde bulundurulduğunda, tez çalışmasında üretilen deglikosile Pfs25 proteini, yüksek verimli protein üretimi, güçlü immünojenik yanıt ve yüksek sıcaklığa karşı stabilite korunması gibi avantajları nedeniyle milyonlarca insan hayatının kurtarılmasına katkıda bulunacak uygun maliyetli bir iletim bloklayıcı aşısının geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.

Özet (Çeviri)

Malaria is a deadly mosquito-borne disease caused by Plasmodium parasites. Despite all efforts worldwide, malaria remains the cause of death for the human population. Today, many vaccine development studies are carried out against malaria. However, there is no vaccine with high protection. Studied vaccines are designed using parasitic life cycle targets especially transmission-blocking (TB) sexual stage antigens such as Pfs25, Pfs230, Pfs48/45. Transmission blocking vaccine (TBV) candidates like Pfs25 prevent the fertilization and maturation of the parasite in the mosquito. Transmission blocking antigens are produced mostly in yeast and plants. In recent years, it has been demonstrated that plant expression systems are promising platforms for the safe, rapid, and cost-effective production of full-length, functional recombinant proteins with high production capacity. Plasmodium parasites lack an N-linked glycosylation mechanism but contain glycosylation sites. When produced in eukaryotic hosts, they undergo aberrant glycosylation, and it causes the low transmission blocking activity. To solve this problem, PNGase F and Endo H in vivo deglycosylation strategies have been developed recently. This strategy has enabled the production of target proteins in a non-glycosylated form by co-expression with the bacterial Endo H deglycosylation enzyme in a plant expression system. The use of this strategy allows for the production of target proteins in native-like structures. Endo H enzymatic deglycosylation strategy has been successfully applied to the production of vaccines against anthrax, malaria, SARS-CoV-2, rabies and for some therapeutics. Pfs25, Plasmodium falciparum mosquito stage antigen, is a promising target for TBVs. It is expressed on the P. falciparum ookinete surface in mosquito stage. Pfs25 is a complex protein in that it is a cysteine-rich protein and contains multiple disulphide bonds. Because of this complex structure, it has been difficult to produce properly folded Pfs25 protein in heterologous systems. Despite these difficulties, some success has been achieved with recombinant versions of Pfs25 proteins produced using yeast and plant transient expression systems. In these studies, recombinant Pfs25 protein showed low transmission blocking activity. To overcome the poor immunogenecity of Pfs25, it is produced by conjugation with another parasite antigens, fusion proteins, adjuvants and so on. Despite all these attempts, the transmission blocking activity of Pfs25 protein could not be increased and it has not been produced in deglycosylated form in any eukaryotic expression system. Production of the deglycosylated form of Pfs25 in N. benthamiana is very important for its transmission blocking activity. Therefore, we aimed to produce P. falciparum mosquito stage antigen Pfs25 protein in N. benthamiana in this thesis. The Pfs25 protein will be produced in both glycosylated and in vivo Endo H deglycosylated form Pfs25 vaccine candidate with high stability and immunogenicity in N. benthamiana plant. In accordance with this purpose, Pfs25 protein was successfully cloned and produced both glycosylated and Endo H deglycosylated form in the N. benthamiana plant. Plant produced proteins were purified by affinity chromatography and characterized in terms of yield, stability, and immunogenicity. The findings of this study indicated that the deglycosylated variant of the Pfs25 protein would be expected to demonstrate high yield, immunogenicity and TB activity compared to its glycosylated form. Considering the results obtained, the deglycosylated Pfs25 protein produced within the scope of the thesis will enable the development of a cost-effective TBV that will contribute to saving millions of lives, thanks to its advantages such as high-efficiency protein production, strong immune response and resistance to high temperatures.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    638059

    Engineering, production, and characterization of glycosylated and in vivo deglycosylated forms of anti-PA83 in Nicotiana benthamiana

    Glikosile ve in vivo deglikosile edilmiş anti-PA83 formlarının Nicotiana benthamiana bitkisinde mühendisliği, üretimi ve karakterizasyonu

    DAMLA YÜKSEL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2020

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TARLAN MAMEDOV

  2. Tez No

    66704

    Ayçiçeği tohum kabuklarındaki antosiyaninlerin ekstraksiyonu ve karakterizasyonu

    Extraction and characterization of anthocyanins in sunflower seed hulls

    AYNUR GÜNENÇ

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    1997

    Gıda Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Gıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARTEMİS KARAALİ

  3. Tez No

    484572

    Şarbon aşı adayı olarak PA83'ün yeni mutant formunun N. benthamiana bitkisinde tasarlanması, ekspsresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu

    Engineering, expression, purification and characterization of new mutant form of PA83 in N. benthamiana plants as antrax vaccine candida

    RIFAT ÜNGÖR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    BiyomühendislikAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TARLAN MAMMEDOV

  4. Tez No

    933071

    Engineering, production and characterization of RBDand nucleocapsid fusion protein

    RBD ve nucleocapsıd füzyon proteininin mühendisliği, üretimi ve karakterizasyonu

    EYLÜL BİLGE SARI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2025

    BiyoteknolojiAkdeniz Üniversitesi

    Tarımsal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NEDİM MUTLU

  5. Tez No

    334843

    Biyokütleden sıvı ürün üretiminde kullanılacakheterojen katalizörlerin sentezlenmesi

    Synthesizing of heterogeneous catalysts used in the production of liquid products from biomass

    PELİN MISIROĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    Kimya MühendisliğiAnadolu Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NEZİHE AZCAN

Geri Dön