Cloning and characterization of heme transport proteins on the outer and the inner membranes of pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas Aeruginosa'nın dış ve iç zarlarındaki heme taşıma proteinlerinin klonlanması ve karakterizasyonu
- Tez No: 824007
- Danışmanlar: PROF. DR. MAOLİN GUO
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2011
- Dil: İngilizce
- Üniversite: University of Massachusetts Darmouth
- Enstitü: Yurtdışı Enstitü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 106
Özet
Demir vücut için gerekli bir elementtir ve bakteriyel virülansta önemli rol oynar. Patojenik bakteri Pseudomonas aeruginosa, çevreden demir çalmak için karmaşık hem alım sistemleri geliştirmiştir. Hem alım sistemlerinden biri, bir dış zar hem reseptörü (PhuR), bir periplazmik hem taşıma proteini (PhuT), bir ATPaz (PhuV) ve ilişkili protein (PhuW) ile birleştirilmiş bir iç zar heme permeazı (PhuU) ve bir sitosolik içerir. hem bağlayıcı protein (PhuS). Bu çalışmada PhuW genleri klonlandı, E. coli'de aşırı eksprese edildi ve 32 kDa His etiketli protein olarak saflaştırıldı. Heme boyama analizleri, izole edilmiş PhuW'nin heme'yi in vitro bağladığını göstermektedir. Floresan ve UV çalışmaları, apo-PhuW'nin hem'i 1:1 stokiyometride (Kd ~ 81 nM) bağladığını ve ferrik hem'in olası bir eksenel ligand olarak tirozin ile 5-koordinatlı olduğunu göstermektedir. CD spektroskopik çalışmaları, PhuW için iyi düzenlenmiş sarmal açısından zengin bir yapı ve apo-PhuW'ye hem bağlanması üzerine çok az ikincil yapı değişikliği olduğunu göstermektedir. PhuW ditiyonit ile indirgenir ancak DTT veya askorbat tarafından indirgenmez. Çoklu dizi hizalaması ve homoloji modellemesi, Tyr166'nın kesinlikle korunduğunu ve muhtemelen PhuW'da hem ligandı olduğunu ortaya koymaktadır. PhuUV (iç zardaki hem geçirgenliği ve ATPaz bileşenleri), pET101D vektörüne klonlanmış ve E. coli'de ifade edilmiştir. PhuV, 30 kDa'lık bir protein olarak Ni-NTA afinite kromatografisi ile saflaştırıldı. Heme içermeyen (apo) PhuV, UV-vis ve floresan titrasyonları ile ortaya konduğu gibi, hem'i submikromolar düzeyde afinite ile 1:1 oranında bağlar. İmidazol ile yapılan titrasyonlar ve ditiyonit ile indirgeme, histidin'in PhuV'deki ferrik hem demiri için olası ligand olduğunu göstermektedir. Hem alım sistemindeki diğer bileşenleri karakterize etmek için PhuR (yabani tip ve birkaç mutasyon PhuRF343C ve PhuRA527C) pET101D vektörlerine klonlandı ve E. coli'de eksprese edildi. PhuR (ve varyantları), 70 kDa protein olarak Ni-NTA afinite kromatografisiyle saflaştırıldı. İn vitro çalışmalar PhuR'nin %1 oktil-polioksietilen varlığında serbest heme bağlandığını göstermektedir. Hem bağlama ve hem taşıma sürecini araştırmak amacıyla Förster Rezonans Enerji Transferi (FRET) tekniğini kullanmak için PhuR, özel olarak tasarlanmış sistein bölgeleri (PhuRF343C ve PhuRA527C) aracılığıyla Alexa Fluor 488 (AF488) ile başarıyla etiketlendi. AF donörünün floresans yoğunluğu, protein heme (akseptör) bağlandığında söndürülür ve apo-PhuRF343C ve apo-PhuRA527C'nin heme'yi sırasıyla 69 ve 108 nM'de afinite ile 1:1 stokiyometride bağladığı bulunur. . Bu yeni membrana bağlı hem taşıma proteinlerinin biyokimyasal karakterizasyonları, bakteriyel hem taşıma yolunun daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.
Özet (Çeviri)
Iron is an essential element for the body and plays important roles in bacterial virulence. Pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosa has evolved sophisticated heme uptake systems to steal iron from environment. One of the heme uptake system contains an outer membrane heme receptor (PhuR), a periplasmic heme transport protein (PhuT), an inner membrane heme permease (PhuU) coupled with an ATPase (PhuV) and associated protein (PhuW), and a cytosolic heme-binding protein (PhuS). In this study, PhuW genes was cloned, over-expressed in E. coli and purified as a 32 kDa His-tagged protein. Heme-staining assays show that the isolated PhuW binds heme in vitro. Fluorescence and UV studies suggest that apo-PhuW binds heme in a 1:1 stoichiometry (Kd ~ 81 nM) and the ferric heme is 5-coordinate with tyrosine as a possible axial ligand. CD spectroscopic studies show a well-ordered helix-rich structure for PhuW and little secondary structure changes upon heme binding to apo-PhuW. PhuW is reduced by dithionite but not by either DTT or ascorbate. Multiple sequence alignment and homology modeling reveals that Tyr166 is strictly conserved and likely to be the heme ligand in PhuW. The PhuUV (heme permease and ATPase components on the inner membrane) have been cloned into pET101D vector, and expressed in E. coli. PhuV was purified by Ni-NTA affinity chromatography as a 30 kDa protein. Heme-free (apo) PhuV binds heme at 1:1 ratio with affinity at the submicromolar level, as revealed by UV-vis and fluorescent titrations. Titrations with imidazole and reduction by dithionite suggest that histidine is the possible ligand for the ferric heme iron in PhuV. In order to characterize the other components in the heme uptake system, PhuR (wild type and a few mutations PhuRF343C and PhuRA527C) have been cloned into pET101D vectors, and expressed in E. coli. PhuR (and its variants) was purified by Ni-NTA affinity chromatography as a 70 kDa protien. In vitro studies indicate that PhuR binds free heme in the presence of 1% octyl-polyoxyethylene. In order to use Förster Resonance Energy Transfer (FRET) technique to probe heme binding and heme transport process, PhuR was successfully labeled with Alexa Fluor 488 (AF488) via specifically engineered cysteine sites (PhuRF343C and PhuRA527C). The fluorescence intensity of the AF-donor is quenched when the protein binds to heme (the acceptor) and it is found that apo-PhuRF343C and apo-PhuRA527C bind heme in a 1:1 stoichiometry, with affinity at 69 and 108 nM, respectively. The biochemical characterizations of these novel membrane-bound heme transport proteins will contribute to a better understanding of the bacterial heme transport pathway.
Benzer Tezler
- Pamukkale termal sularından izole edilen Bacillus licheniformis'ten katalaz enziminin klonlanması, ekspresyonu, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Catalase from a local Bacillus licheniformis species isolated from pamukkale hot springs: Cloning, expression, purification and characterization
MEHMET ÖZKARSLI
- Functional and structural analysis of catalase-phenol oxidase from Scytalidium thermophilum
Scytalidium thermophilum katalaz-fenol oksidazının fonksiyonel ve yapısal analizi
YONCA YÜZÜGÜLLÜ
Doktora
İngilizce
2010
BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MİCHAEL J. MCPHERSON
PROF. DR. ZÜMRÜT B. ÖGEL
- Evaluation of edible films with palmarosa oil as active food packaging for kashar cheese
Kaşar peyniri için aktif gıda ambalajı olarak palmarosa yağı ilaveli yenilebilir filmlerin değerlendirilmesi
NEFİSE BEGÜM KIRCI
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Besin Hijyeni ve Teknolojisiİstanbul Teknik ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. NEŞE ŞAHİN YEŞİLÇUBUK
- Cloning and characterization of a lipase enzyme isolated from metagenomic libraries
Metagenomik kütüphanelerinden izole edilen bir lipaz enziminin klonlanması ve karakterizasyonu
FATMA FEYZA ÖZGEN
Yüksek Lisans
İngilizce
2017
Biyoteknolojiİstanbul ÜniversitesiGenetik ve Biyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMİNE ŞEKÜRE NAZLI ARDA
- Cloning and characterization of novel NOD like receptors as cytoplasmic immune sensors
Sitoplazmik bağışıklık alıcıları olarak yeni NOD ailesi alıcıların klonlanması ve karakterizasyonu
YETİŞ GÜLTEKİN
Yüksek Lisans
İngilizce
2011
BiyolojiBoğaziçi ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. NESRİN ÖZÖREN
