Investigating genetic and epigenetic regulators of human naive pluripotent stem cells
İnsan naif pluripotent kök hücrelerinin genetik ve epigenetik düzenleyicilerinin araştırılması
- Tez No: 836731
- Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Tıbbi Biyoloji, Medical Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2023
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Koç Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 153
Özet
Pluripotent kök hücreler, naif veya primed (meyilli) olarak adlandırılan iki temel hücresel durumda bulunabilirler. Naif pluripotent kök hücreler, geleneksel hazır durumlarla karşılaştırıldığında gelişimsel yetenek açısından üstün bir konuma sahiptirler. Ancak insan naif pluripotent kök hücrelerinin üretilmesi ve korunması zorlu bir süreçtir. Bu nedenle, naif hücreleri izole etmek ve ilişkilendirilen genetik ve epigenetik düzenleyicileri açığa çıkarmak için araçlar geliştirmek önemlidir. Amacımız, heterojen kültürlerden naif hücreleri izole etmek için bir haberci oluşturmak, naif indüksiyon protokollerini optimize etmek ve naif durum kazanımının düzenleyicilerini ortaya çıkarmaktı. İfade verilerine dayanarak, naif pluripotent kök hücrelerde özellikle ifade edilen bir gen olan KLF17'yi seçtik. Bu nedenle, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerinde (iPSCs) KLF17-T2A-EGFP floresan bir haberci oluşturmak için CRISPR/Cas9 tabanlı genom düzenleme kullanarak bir KLF17-T2A-EGFP floresan habercisini oluşturduk. Bu GFP tabanlı haberci sistemini naif dönüşüm adımları sırasında test ettik. EGFP ifadesinin kantitatif PCR analizi, naif özgü aktivasyonu gösterdi ve bu da raporun başarılı bir şekilde oluşturulduğunu gösterdi. Naif kök hücrelerin dönüşümünü optimize etmek devam eden bir zorluktur. KLF17 ve NANOG/LIN28A'nın naif indüksiyon üzerindeki etkilerini test ettik. Kantitatif PCR sonuçları, bu transkripsiyon faktörlerinin kontrollere göre naif belirteçlerin aktivasyonunu artırdığını gösterdi, bu da onların sıfırlamayı hızlandırabileceğini düşündürdü. Ayrıca, KLF17 ve NANOG aşırı ifadesinin somatik hücrelerden hem primed hem de naif yeniden programlamada etkilerini değerlendirmeyi amaçladık. Sonuçlar, KLF17 aşırı ifadesinin yeniden programlama verimini etkilemediğini gösterdi. Ancak NANOG aşırı ifadesi hem primed hem de naif yeniden programlamanın verimini artırdı. Ayrıca, naif ve primed yeniden programlama üzerinde KLF5, KLF17 ve LIN28A transkripsiyon faktörlerinin nakavt etkilerini araştırdık. KLF5 nakavtı her iki programlamayı da etkilemedi. Ancak KLF17 nakavtı özellikle naif yeniden programlamanın verimini azalttı, primed yeniden programlamayı etkilemedi. Bunun aksine, LIN28A nakavtı hem primed hem de naif yeniden programlamanın verimini azalttı. Son olarak, epigenetik düzenleyicilerin küçük molekül inhibitörlerini primed ve naif yeniden programlama üzerinde test ettik. İCBP112, İBRD9, RN1, A83-01 ve EPZ5676 inhibitörleri hem primed hem de naif koşullar altında yeniden programlama verimini önemli ölçüde artırdı. Tüm bu sonuçlar, somatik hücrelerden primed ve naif kimlik kazanımını etkileyen hem transkripsiyon faktörlerinin hem de epigenetik düzenleyicilerin rolünü göstermektedir.
Özet (Çeviri)
Pluripotent stem cells can exist in two primary cellular states referred to as naive or primed. Naive pluripotent stem cells possess enhanced developmental potency compared to conventional primed states. However, generating and maintaining human naive pluripotent stem cells remains challenging. Developing tools to isolate naive cells and elucidate associated genetic and epigenetic regulators is therefore essential. We aimed to create a reporter for isolating naive cells from heterogeneous cultures, optimize naive induction protocols, and uncover regulators of naive status acquisition. Based on expression data, we selected KLF17 as a gene specifically expressed in naive pluripotent stem cells. Therefore, we engineered a KLF17-T2A-EGFP fluorescent reporter in human induced pluripotent stem cells (iPSCs) using CRISPR/Cas9-based genome editing. We tested this GFP-based reporter system during naive conversion steps. Quantitative PCR analysis of EGFP expression showed naive-specific activation, indicating successful construction of the reporter. Optimizing the conversion of naive stem cells is an ongoing challenge. We tested the effects of overexpressing KLF17 and NANOG/LIN28A on naive induction. qPCR results demonstrated these transcription factors increased activation of naive markers compared to controls, suggesting they may accelerate resetting. We also aimed to assess the effects of KLF17 and NANOG overexpression on naive and primed reprogramming efficiency from somatic cells. The results showed that overexpression of KLF17 did not affect reprogramming efficiency. However, NANOG overexpression increased the efficiency of both primed and naive reprogramming. In addition, we investigated the impacts of knocking out transcription factors KLF5, KLF17, and LIN28A on naive and primed reprogramming. KLF5 knockout did not affect either reprogramming system. But KLF17 knockout specifically decreased naive reprogramming efficiency while not affecting primed reprogramming. In contrast, LIN28A knockout reduced the efficiency of both primed and naive reprogramming. Lastly, we tested small molecule inhibitors of epigenetic regulators on primed and naive reprogramming. The inhibitors iCBP112, iBRD9, RN1, A83-01, and EPZ5676 all significantly increased reprogramming efficiency under both primed and naive conditions. Taken together, these results demonstrated that both transcription factors and epigenetic regulators affect the acquisition of primed vs. naive identity from somatic cells.
Benzer Tezler
- Meta-analysis of gene expression heterogeneity in brain development and aging
Beyin gelişimi ve yaşlanmasında gen anlatımı heterojenliğinin meta-analizi
ULAŞ IŞILDAK
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyolojiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET SOMEL
- Investigating the roles of CREBBP/EP300 and BRD9 in somatic cell reprogramming to pluripotency
CREBBP/EP300 ve BRD9'un somatik hücrelerin pluripotensiye yeniden programlamasındaki rollerinin araştırılması
KENAN SEVİNÇ
Doktora
İngilizce
2021
GenetikKoç ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
- Vitamin D3'ün multiple myeloma hücrelerinde uzun kodlayıcı olmayan RNA (lncRNA) ifadesine etkisinin incelenmesi
Examination of the effect of Vitamin D3 on long non-coding RNA (lncRNA) expression in multiple myeloma cells
KÜBRA NUR BOSTANCI
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
BiyolojiBurdur Mehmet Akif Ersoy ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ AYŞE KIZILYER
- Timokinon tedavisinin sporadik alzheimer modeli oluşturulmuş sıçan beyin dokusundaki mikroRNA ve mRNA ekspresyonu üzerindeki etkisinin araştırılması
Investigating the mechanism on expression of MRNA and microrna triggered by timoquinon treatment in brain of sporadic alzheimer's disease model rats
TUĞÇE AYDOĞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
BiyoteknolojiBezm-i Alem Vakıf ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FAHRİ AKBAŞ
- DNA metil transferaz enzimlerinin yaşlanma ile ilgili insan klotho geni anlatımı üzerine etkilerinin araştırılması
Investigation of effects of DNA methyltransferase enzymes on aging-related human klotho gene expression
ELİF ÇAĞLAYAN