Geri Dön

Investigating the roles of CREBBP/EP300 and BRD9 in somatic cell reprogramming to pluripotency

CREBBP/EP300 ve BRD9'un somatik hücrelerin pluripotensiye yeniden programlamasındaki rollerinin araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 728818
  2. Yazar: KENAN SEVİNÇ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. TEVFİK TAMER ÖNDER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Genetics, Molecular Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2021
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Koç Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 149

Özet

Somatik hücreler, dört transkripsiyon faktörünün; OCT4, SOX2, KLF4 ve MYC (OSKM) anlatımıyla, uyarılmış pluripotent kök hücrelere (uPKH) yeniden programlanabilir. Somatik hücrelerin kimliğini muhafaza eden epigenetik yolaklar, somatik hücrelerin yeniden programlamasına engeldir. Bu tarz yolakların kimyasal veya genetik inhibisyonu yeniden programlama verimini arttırmaktadır. Bu tezde, üç kromatin faktörünün; CREBBP, EP300 ve BRD9'un yeniden programlamaya etkisini kimyasal ve genetik işlev kaybı deneyleriyle araştırdım. Tezin ilk bölümde, spesifik inhibitörlerle CREBBP/EP300'ün bromodomain'inin yeniden programlamaya engel olma fonksiyonunu araştırdım. RNA-dizileme, CREBBP/EP300 bromodomain inhibisyonunun fibroblastlarda çok ifade edilen genlerin anlatımını azalttığını göstermiştir. Ancak, CREBBP/EP300'ün A485 kimyasalıyla asetiltransferaz aktivitesi inhibe edilince pluripotensi genlerinin anlatımı düşerek yeniden programlama verimi azalmıştır. Transpozaz erişebilir kromatin analizi sonrası dizileme (ATAC-dizileme), H3K4me1 ve H3K27ac kromatin immün-çöktürme sonrası dizileme (ChIP-dizileme) sonuçları H3K27ac seviyesinin, erişilebilir kromatin ve olası enhancer (arttırıcı) bölgelerinde CREBBP/EP300 bromodomain inhibisyonuyla azaldığını göstermiştir. Buna ek olarak, CREBBP/EP300 bromodomain inhibisyonuyla anlatımı azalan transkripsiyon faktörlerinden biri olan PRRX1'in devamlı anlatımının uPKH oluşumunu pluripotensiyle alakalı genlerin anlatımını baskılayarak engellediğini fonksiyonel olarak gösterdim. Bu sonuçlar CREBBP/EP300'ün asetillenmiş lizinlerle etkileşiminin, somatik hücrelerin kimliğini muhafaza ettiğini ortaya çıkarmıştır. Tezimin ikinci bölümünde, yeniden programlamayı düzenleyen faktörleri bulmak için CRISPR-Cas9 aracılığıyla SWI/SNF komplekslerine odaklanmış bir tarama yaptım. Bu tarama, kanonik olmayan ncBAF kompleksinin spesifik elemanlarından BRD9 ve GLTSCR1'in yeniden programlamaya engel olduklarını buldu. Buna ek olarak, üç farklı BRD9 bromodomain inhibitörünün ve BRD9 yıkıcısının yeniden programlama verimini arttırdığını, sadece OCT4 ve SOX2 anlatımıyla uPKH oluşumunu sağladığını gösterdim. BRD9 nakavt uPKH'lar pluripotensi belirteçlerini üretmesi, kısa süreli BRD9 inhibisyonunun hücre bölünmesi ve OCT4 pozitif hücre sayısını azaltmaması BRD9'un pluripotensi oluşumu ve devamlılığında vazgeçilebilir olduğuna işaret etmektedir. Ancak, BRD9 kaybı ve inhibisyonu, uPKH'ların mezoderme farklılaşmasını azaltmıştır. Fibroblastlarda RNA-dizilemesi yapılmış ve sonuçlar BRD9 inhibisyonunun bu hücrelerde anlatımı fazla olan genleri baskıladığını göstermiştir. ATAC-dizilemesi, erişebilir kromatinin promotör yerine olası aktif enhancer (arttırıcı) bölgelerinde BRD9 inhibisyonuyla azaldığını göstermiştir. Buna ek olarak, BRD9 inhibisyonuyla anlatımı azalan transkripsiyon faktörlerinden ZBTB38 ve MN1'in anlatımını arttırmak yeniden programlama verimini azaltmıştır. Bu sonuçlar, BRD9 ve ncBAF kompleksinin enhancer'lar aracılığıyla somatik hücrelerin kimlikleri muhafaza ettiğine işaret etmektedir. Bu tezde sunulan bulgular, somatik hücre kimliğini muhafaza eden kromatin faktörlerinin yeniden programlamaya engel olduğunu ve bu tarz faktörlerin inhibisyonunun düşük verimli uPKH oluşumunu arttırmakta kullanılabileceği gösterilmiştir.

Özet (Çeviri)

Somatic cells can be reprogrammed to induced pluripotent stem cells (iPSC) by overexpressing four transcription factors, OCT4, SOX2, KLF4 and MYC (OSKM). Epigenetic pathways that safeguard somatic cell identity are barriers for somatic cell reprogramming. Chemical or genetic inhibition of such pathways increases the efficiency of reprogramming. In this thesis, I investigated the effects of three chromatin factors CREB (cyclic-AMP response element binding protein) binding protein (CREBBP), E1A binding protein of 300 kDa (EP300) and bromodomain containing 9 (BRD9) during reprogramming using a combination of chemical probes and genetic loss of function experiments. In the first chapter, I investigated barrier function of bromodomain-mediated interaction of CREBBP/EP300 in reprogramming with specific bromodomain inhibitors. RNA-Sequencing showed that CREBBP/EP300 bromodomain inhibition in fibroblasts decreases the expression of genes that are highly expressed in the cells. However, inhibition of the acetyltransferase activity of CREBBP/EP300 by another small molecule, A485, decreased the reprogramming efficiency by downregulating pluripotency-associated genes. Assay for transposase-accessible chromatin (ATAC-Sequencing) and H3K4me1 and H3K27ac chromatin immune-precipitation (ChIP-Sequencing) results indicated that CREBBP/EP300 bromodomain inhibition decreases H3K27ac at accessible chromatin regions and at putative enhancers. Additionally, I functionally showed that continuous expression of PRRX1, a downregulated transcription factor upon CREBBP/EP300 bromodomain inhibition, impairs iPSC generation by suppressing pluripotency-related gene expression. These results uncovered a role for the interaction of CREBBP/EP300 with acetylated lysines in safeguarding somatic cell identity. In the second chapter of my thesis, I performed a SWI/SNF-focused CRISPR-Cas9-mediated knockout screen to identify regulatory subunits of reprogramming. This screen identified non-canonical BRG1- or BRM-associated factors (ncBAF) specific subunits, BRD9 and BRD4 Interacting Chromatin Remodeling Complex Associated Protein (BICRA, GLTSCR1) as barriers to reprogramming. Additionally, I showed that three structurally distinct BRD9 bromodomain inhibitors and a PROteolysis Targeting Chimera (PROTAC) degrader of BRD9 increase reprogramming efficiency and generate iPSCs with only OCT4 and SOX2 expression. BRD9 knockout iPSCs expressed pluripotency markers and short term BRD9 inhibition did not decrease cell proliferation and OCT4-positive cells indicating that BRD9 is dispensable for pluripotency induction and maintenance. However, BRD9 depletion and inhibition impaired mesoderm differentiation of iPSCs. RNA-Seq was performed on fibroblasts and results showed that BRD9 inhibition downregulates highly expressed genes in fibroblasts. ATAC-Seq results showed that chromatin accessibility around putative active enhancers rather than promoters was decreased upon BRD9 inhibition. Additionally, overexpression of MN1 and ZBTB38, which were downregulated upon BRD9 perturbations, decreased reprogramming efficiency. These results indicate a role for BRD9 and ncBAF in maintaining somatic cell identity through maintenance of active enhancers. The findings presented in this thesis show that chromatin factors safeguarding somatic cell identity are barriers to cellular reprogramming and inhibition of such factors can be utilized to increase the low efficiency of human iPSC generation.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    780386

    Diyafragma gelişim defektlerinden sorumlu genlerin yeni nesil dizileme teknolojileri ile araştırılması

    Investigation of genes responsible for diaphragmatic developmental defects with next generation sequencing technologies

    SOMAYYEH HEIDARGHOLIZADEH

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Genetikİstanbul Üniversitesi

    Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BİRSEN KARAMAN

    DR. ÖĞR. ÜYESİ ÇAĞRI GÜLEÇ

  2. Tez No

    789603

    Investigating the roles of self-compassion, body image flexibility, and societal appearance influences on body appreciation among adolescents

    Ergenlerde öz-şefkat, beden imajı esnekliği ve sosyal dış görünüş etkilerinin beden memnuniyeti üzerindeki rolünün incelenmesi

    BÜŞRA VURKUN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    PsikolojiBahçeşehir Üniversitesi

    Psikolojik Danışma ve Rehberlik Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ NAZLI BÜŞRA AKÇABOZAN KAYABOL

  3. Tez No

    255392

    Investigating the roles of micrornas in biotic stress responses and functional characterization of a novel ZTL-type F-box protein via virus induced gene silencing

    Mikrorna'ların biyotik stres koşullarındaki görevlerinin araştırılması ve yeni bir ZTL-tipi F-box proteininin vırüs indüklenmesi ile gen susturulması yöntemi ile fonksiyonel karakterizasyonu

    YASİN FATİH DAĞDAŞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2009

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MAHİNUR S. AKKAYA

  4. Tez No

    834460

    Investigating the roles of psychological control and parental maladaptive perfectionism on the relationship between parental separation anxiety and obsessive-compulsive symptoms among adolescents

    Ebeveyn ayrılık kaygısı ve ergenlerdeki obsesif-kompulsif belirtileri arasındaki ilişkide psikolojik kontrol ve ebeveyn uyumsuz mükemmeliyetçilik rolünün incelenmesi

    BERKE KESKİN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    PsikolojiTED Üniversitesi

    Psikoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ILGIN GÖKLER DANIŞMAN

    DOÇ. DR. EMRAH KESER

  5. Tez No

    584372

    Investigating the roles of adverse childhood experiences and father involvement on the transmission of early maladaptive schemas

    Erken dönem şemaların aktarımında erken dönem olumsuz yaşantıların ve baba katılımının rolünün incelenmesi

    ZEYNEP ZEYNEL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    PsikolojiTED Üniversitesi

    Psikoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. TUĞBA UZER YILDIZ

Geri Dön