Geri Dön

Kurkumin yüklü PLGA-DSPE hibrit nanopartiküllerin hazırlanması, karakterizasyonu ve in vitro etkinliğinin incelenmesi

Preparation, characterisation and in vitro evaluation of curcumin loaded PLGA-DSPE hybrid nanoparticles

PDF İndir

  1. Tez No: 842765
  2. Yazar: FATMANUR BABALI BALIBEY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ABDÜRRAHİM KOÇYİĞİT
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyokimya, Biyoteknoloji, Eczacılık ve Farmakoloji, Biochemistry, Biotechnology, Pharmacy and Pharmacology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 175

Özet

Poly (D, L Lactic-co-Glycolic acid) (PLGA) biyouyumlu, biyobozunur ve FDA onaylı bir biyopolimerdir. Bu polimer, emülsiyon- solvent evaporasyon yöntemi ile nano miseller hazırlanmasının kolay olması ayrıca, hidrofobik ilaçların taşınması için elverişli olması ile diğer biyouyumlu polimerlerden ayrılmaktadır. Kurkumin ise, Curcuma longa rizomlarından izole edilen, çok sayıda önemli biyolojik aktiviteye sahip bir doğal bileşiktir. Bu biyoaktivitelerin arasında ilk olarak kanser hücrelerinin kurkumin etkisiyle proliferasyonunun inhibe edilmesi ve apoptoza yönelmesi gelmektedir. Buna ek olarak kurkuminin kemoterapi ilaçlarının indüklediği direnç ile ilişkili genlerin aktivasyonunu ve proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürdüğü bilinmektedir. Bu proteinlerin ekspresyon seviyesini düşürmek, kanser hücrelerinde ortaya çıkan kemoterapi direncinin gelişmesini engellemeyi ve kemoterapi ilacının daha etkili hale gelmesini sağlamaktadır. Daha önce laboratuvarımızda yapılan PLGA nano-misellerine 125 g/mL kurkumin yüklemiş ve uygulandığı kanser hücrelerinde NF-κB seviyelerindeki değişim incelemiştir. Bu çalışmanın sonucunda kurkumin'in NF-κB seviyesini düşürmekte başarılı olduğu ancak PLGA nano-misellerinin bu proteinin tüm alt birimlerini etkin şekilde düşürmek için gerekli olan konsantrasyona ulaşamadığı fark edilmiştir. Bu sorun iki sebepten kaynaklanmış olabilir. Kurkumin NF-κB'nin tüm alt birimlerinin seviyesini düşüremeyen bir bileşiktir veya PLGA'nın taşıdığı kurkumin miktarı bu etkinliği elde etmek yetersizkalmaktadır. Bu tez çalışması ile amacımız, PLGA'nın kurkumin taşımak için sahip olduğu hidrofobik kapasiteyi yine biyouyumlu ve FDA onaylı bir fosfolipit olan DSPE ile arttırmaktır. Bunun için“Emülsifikasyon- Solvent Evaporasyon”ve“Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi”olmak üzere iki farklı yöntem ile PLGA-DSPE hibrit nano-miselleri hazırlandı, hesaplamalı moleküler modelleme yöntemleri ile polimer ve lipidin uyumu incelenmiş ve fizikokimyasal olarak karakterizasyonu tamamlandı. Ardından kurkumin taşımak için hidrofobik kapasitesi geliştirilen PLGA'nın bir kemoterapi ajanı olan 5 – Flourourasil (5-FU) kullanıldığında biyolojik etki açısından iyileşme davranışları in vitro olarak incelenmiştir.“Film Oluşturma–Rehidratasyon Yöntemi”yöntemi ile hazırlanan nanomiseller ile taşınan kurkumin miktarının 250 g/mL'ye kadar yükseldiği başarılı bir şekilde gösterilmiştir. Kurkumin yüklü nano-misellerin fizikokimyasal karakterizasyonu Dynamic Light Scattering (DLS) FT-IR, Differential Scanning Chalorimetry (DSC) ve HPLC ile gerçekleştirilmiştir. DLS yöntemi ile boyutu 120 nm (sayıca %) olarak tespit edilen nano-misellerde DSC ve FT-IR yöntemleri ile kurkumin'in başarılı bir şekilde nano-partikülün çekirdek kısmına yerleştiği ve DSPE'nin PLGA'nın tüm fonksiyonel grupları ile etkileştiği tespit edilmiştir. HPLC yöntemi ile oluşturulan hibrit nano-miselin içinde tuzağa düşürülen kurkumin miktarının yüzde enkapsülasyon etkinliği (%EE) %92,006 ve yükleme kapasitesi (%DL) %7,301 olarak ölçülmüştür. Kurkumin'in hibrit nano-miselden salım mekanizması incelenmiş ve Korsmeyer–Peppas modelinin en uygun model olduğu tespit edilmiştir. Buna göre kurkumin'in hibrit nano-misellerden salımının nano-taşıyıcının şişmesine bağlı olarak, difüzyon ile gerçekleştiği ortaya çıkmıştır. Elde edilen optimize formülasyonun stabilitesi yukarıda bahsedilen analiz yöntemleri ile, çeşitli ortam (oda sıcaklığı, liyoflizasyon sonrası ve besiyerinde) ve çeşitli sürelerde incelenmiş ve hazırlanan formülasyonun yüksek ölçekte üretim sırasında pazarlamaya uygun olduğu tespit edilmiştir. Tüm bunlarla birlikte kurkumin yüklü DSPE-PLGA hibrit nano-miselleri için hesaplamalı moleküler modelleme çalışmaları (kuantum kimyasal küme modelleri ve periyodik DFTB+ hesaplamaları) gerçekleştirilmiştir. Sonuç olarak oluşturulan PLGA, DSPE ve kurkumin matriksinde kurkumin'in sadece DSPE veya PLGA ile değil, her ikisi ile etkileşimde olduğu, DSPE'nin PLGA zincirlerini bir arada tutmakta büyük etkisi olduğu ve üçlü sistemin birlikte oldukça kararlı bir sistem ortaya çıkardığı tespit edilmiştir. Bu sonuç stabilite çalışmaları ile uyumludur. Son olarak 250 mg/mL kurkumin taşıyan optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin in vitro biyolojik etkisi LoVo insan kolorektal kanser hücre hattı ve sağlıklı kolon hücre hattı CCD-1072Sk üzerinde incelenmiştir. Bunun için öncelikle 5-FU'nun IC50 değeri 440.9 M olarak hesaplanmış ve ilerleyen deneylerde 5-FU'nun bu konsantrasyonu kurkumin yüklü optimize hibrit nano-miseller ile kombinasyon halinde kullanılmıştır. Optimize formülasyonun kanser hücreleri üzerindeki apoptoz etkisi akridin turuncusu (AO)/ etidyum bromür (EB) çift boyaması, DAPI boyama, floresan mikroskop incelemesi ve akış sitometrisi cihazında Annexin V-FITC ve PI boyama ile gerçekleştirilmiş ve optimize formülasyonun apoptoz üzerindeki etkisi serbest kurkumin'e kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Bunu takiben Western Blot yöntemi ile apoptotik protein artışı incelenmiştir. P53 proteininin, NP ile 5-FU kombinasyon uygulaması sonucu oluşan protein ekspresyon düzeylerinin yalnızca NP uygulamasına kıyasla anlamlı düzeyde yüksek olduğu sonucu elde edilmiştir. Bununla uyumlu olarak kemoterapi ve hibrit nano-taşıyıcının taşıdığı kurkumin'in kombine kullanımında hücre içi rekatif oksijen türleri (ROS) oranlarında anlamlı artış gözlenmiştir. Son olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-misellerinin kurkumin'in hücre içine girişindeki etkisi incelenmiştir. Sonuç olarak optimize DSPE-PLGA hibrit nano-miselinin PLGA'nın kurkumin taşıma kapasitesinin başarılı bir şekilde iki katına çıkardığı tespit edilmiş ve 5-FU ile kombine tedavide kemoterapinin etkinliğini arttırdığı tespit edilmiştir. In vivo çalışmalar ile hazırlanan optimize hibrit nano-formülasyonun etkinliğini incelemek araştırmanın bir sonraki basamağı olarak tasarlanmıştır.

Özet (Çeviri)

It is a very common method to use polymer and lipid structured biological materials in the preparation of nano drug carrier systems. Poly (D, L Lactic-co-Glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible, biodegradable, and FDA-approved biopolymer. It is very easy to produce nano-micelles from this polymer and is suitable for transporting hydrophobic drugs, distinguishing it from other biocompatible polymers. Apart from this, Curcumin is a natural compound isolated from the rhizomes of the Curcuma longa plant, also known as turmeric, and has many important bioactivities for humans. It has been reported that curcumin has cell cycle-inhibiting, proliferation-interfering, anti-inflammatory and apoptosis-inducing effects on cancer cells. Among these bioactivities, the inhibition of cancer cell proliferation and increase their tendency to apoptosis are first. In addition, Curcumin is known to reduce the level of proteins associated with chemotherapy resistance. Reducing the expression level of these proteins prevents the development of chemotherapy resistance in cancer cells and makes the chemotherapy drug more effective. Our group had previously conducted many studies with PLGA nano-micelles, and in one of them, they loaded 125 g/mL Curcumin into the nano-micelle and examined the change in NF-κB levels in cancer cells it administered. As a result of this study, it was noticed that curcumin was successful in reducing the level of NF-κB, but the amount required to reduce all subunits of this protein was insufficient. This problem could be caused by two reasons. Curcumin is a compound that cannot reduce the level of all subunits of NF-κB or the amount of curcumin carried by PLGA is too small to achieve this effectiveness. Similarly, the reason why the in vivo activity of curcumin is not found to be high enough is due to the insufficient bioavailability of the molecule and consequently the molecule accumulates in the target area in too low amounts. In order to fully measure the relationship between curcumin-loaded nanocarriers and resistance, a high amount of curcumin must first be delivered to the target. In this thesis, we tried to increase the hydrophobic capacity of PLGA to transport curcumin with DSPE, which is a biocompatible and FDA-approved phospholipid. For this purpose, PLGA-DSPE hybrid nano-micelles were prepared with two different methods, namely“Emulsification-Solvent Evaporation”and“Film Preparation-Rehydration Method”and their physicochemical characterization was completed. Afterward, PLGA, with enhanced hydrophobic capacity for carrying curcumin, was used with 5-FU, a chemotherapy agent, and the healing behaviors regarding biological effects were examined in-vitro. It has been successfully shown that the amount of curcumin carried by nano micelles prepared by the“Film Formation-Rehydration Method”method increases up to 250 g/mL. Physicochemical characterization of curcumin-loaded nano-micelles was performed with Dynamic Light Scattering (DLS) FT-IR, Differential Scanning Chalorimetry (DSC), and HPLC. It was determined that curcumin was successfully encapsulated in the core of the nano-particle and DSPE interacted with all functional groups of PLGA by DSC and FT-IR methods in nano-micelles whose size was determined as 120 nm (number%) by the DLS method. The percent encapsulation efficiency (%EE) of the amount of curcumin trapped in the hybrid nano-micelle formed by HPLC method was measured as 92.006% and the drug loading capacity (DL%) as 7.301%. The release mechanism of curcumin from the hybrid nano-micelle was investigated and the Korsmeyer–Peppas model was found to be the most suitable one. Accordingly, it was revealed that the release of curcumin from hybrid nano micelles occurs by diffusion due to swelling of the nanocarrier. The stability of the obtained optimized formulation was examined by the above-mentioned analysis methods, in various media (room temperature, after lyophilization, and in the medium) and at various times, and it was determined that the prepared formulation was suitable for marketing during high-scale production. In addition, Computational Molecular Modeling for curcumin-loaded DSPE-PLGA hybrid nano micelles was performed with Quantum chemical cluster models, Periodic DFTB+ calculations, and Molecular dynamics (MD) simulations. As a result, it has been determined that curcumin interacts not only with each DSPE or PLGA individually but with both, DSPE has a great effect on keeping the PLGA chains together, and the triple system together creates a very stable system in the formed PLGA, DSPE and curcumin matrix. This result is compatible with stability studies. Finally, the in vitro biological effect of optimized DSPE-PLGA hybrid nano micelles carrying 250 µg/mL curcumin was investigated on transfected LoVo human colorectal cancer cell line (LoVo-Luc) and Healthy colon cell line CCD-1072. For this, firstly, the IC50 value of 5-FU was calculated as 440.9 M, and in further experiments, this concentration of 5-FU was used together with optimized hybrid nano-micelles loaded with curcumin. The apoptosis effect of the optimized formulation on cancer cells was performed by Acridine orange (AO) / ethidium bromide (EB) double staining, DAPI staining, fluorescence microscopy, and Annexin V-FITC and PI staining on flow cytometry. The effect of the optimized formulation on apoptosis was statistically compared to free curcumin and was found significant. Following this, apoptotic protein increase and resistance-related beta catenin protein were examined by Western Blot method. It was concluded that the protein expression levels of the mentioned proteins resulting from the combination application of drug-loaded nanoparticles and 5-FU were significantly higher than the application of nanoparticles alone. In line with this, a significant increase in intracellular reactive oxygen species (ROS) rates were observed in the combined use of chemotherapy and curcumin carried by the hybrid nanocarrier. Finally, the effect of optimized DSPE-PLGA hybrid nano-micelles on the intracellular entry of curcumin was investigated. As a result, It was determined that the optimized DSPE-PLGA hybrid nano-micelle successfully doubled the curcumin carrying capacity of PLGA and increased the efficacy of chemotherapy in combination treatment with 5-FU. Examining the effectiveness of the optimized hybrid nano-formulation prepared by in vivo studies was designed as the next step of the research.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    528045

    Synthesis and optimization of curcumin loaded levan- PLGA nanoparticles for targeted cancer therapy

    Hedefli kanser tedavisine yönelik kurkumin yüklü levan-PLGA nanopartiküllerinin sentezlenmesi ve optimizationu

    ZAHRA ESKANDARI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    BiyomühendislikMarmara Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. EBRU TOKSOY ÖNER

    DR. ÖĞR. ÜYESİ FATEMEH BAHADORI

  2. Tez No

    638838

    Polisorbat 80 kaplı, kurkumin ve dosetaksel yüklü PLGA nanopartiküller sistemlerin geliştirilmesi ve beyin tümörü etkinliklerinin değerlendirilmesi

    Synthesis, evaluation of in vitro and in vivo activities of curcumin and docetaxel loaded polysorbate 80 coated PLGA nanoparticulate systems

    INDRIT SEKO

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Eczacılık ve FarmakolojiHacettepe Üniversitesi

    Farmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. YILMAZ ÇAPAN

  3. Tez No

    639052

    Peptit kaplı ve kemoterapötik ilaç yüklü süperparamanyetik demiroksit nanopartiküllerin sentezi ve glioblastoma hücre hattında kullanılmak üzere hipertermi maruziyet sisteminin geliştirilmesi

    Synthesis of peptide coated and chemotherapeutic drug loaded superparamagnetic iron oxide nanoparticles and development of a hyperthermia exposure system for use in glioblastoma cell lines

    FATİH ŞENTÜRK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    BiyofizikGazi Üniversitesi

    Biyofizik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÖKNUR GÜLER ÖZTÜRK

  4. Tez No

    868166

    Çift hedefli biyouyumlu nanopartiküllerin pankreas kanseri üzerine etkisi

    The effect of the dual-targeting biomimetic nanoparticles on pancreatic cancer

    AYŞE NUR NURDOĞAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Biyolojiİstanbul Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. AYŞE KARATUĞ KAÇAR

  5. Tez No

    831743

    Design and fabrication of implantable patches for controlled drug release applications

    Kontrollü ilaç salım uygulamaları için implante edilebilir yamaların tasarımı ve üretimi

    EDA GÜNEY

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Mühendislik BilimleriSabancı Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. GÖZDE İNCE

Geri Dön