Optimization and risk assessment of RAB27A-/- Gene Therapy alternatives using current molecular techniques and technologies
Güncel moleküler teknikler ve teknolojiler kullanılarak RAB27A-/- Gen Tedavi alternatiflerinin optimizasyonu ve risk değerlendirilmesi
- Tez No: 845985
- Danışmanlar: DOÇ. DR. FATİMA SUSANNA FAUSTİNA AERTS KAYA
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Genetik, Moleküler Tıp, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Griscelli Sendromu Tip 2, CRISPR/Cas9, lentivirüs, kök hücreler (*), Griscelli Syndrome Type 2, CRISPR/Cas9, lentivirus
- Yıl: 2024
- Dil: İngilizce
- Üniversite: Hacettepe Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kök Hücre Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 198
Özet
Griscelli Sendromu Tip 2 (GS-2), ekzositoz ve membran trafiğinde rol oynayan RAB27A geninde meydana gelen mutasyonların neden olduğu bir immün yetersizliktir. Bu tez kapsamında 1) GS-2 MKH'leri ve uPKH hatlarını kullanarak RAB27A'nın CRISPR/Cas9 gen düzenlemesinin etkinliğini; 2) LV vektörlerinin SFFV, PGK ve UCOE promoterlerinin kontrolünde MSC'lere aktarım ve RAB27A ekspresyon etkinliğini ve 3) immun yetmezlikli farelerde RAB27A'nın aşırı ifadesine bağlı potansiyel riskleri araştırılmıştır. RAB27A'daki mutasyonları hedef alan CRISPR/Cas9 elemanları tasarlanmış ve GS-2 MKH ve uPKH hatlarında gen düzeltme etkinliği test edilmiştir. Yeni bir GS-2 uPKH hattı oluşturulmuştur ve hücre kültürü/dondurma yöntemi optimize edilmiştir. RAB27A'nın CRISPR/Cas9 yöntemi ile düzeltilmesi mümkün olmasına rağmen kök hücrelerin hayatta kalım oranı düşük olarak bulunmuştur. GS-2 MKH'lere LV transdüksiyonu yapıldığında en yüksek ifadeyi SFFV'nin sağladığı ardından PGK ve UCOE'nun takip ettiği gösterilmiştir. RAB27A+ MKH'ler ve HKH'ler, immun yetmezlikli farelere nakledilmiştir ancak tümör oluşumuna neden olmamıştır. Ancak RAB27A'nın aşırı ifadesinin kök hücre fonksiyonunu etkilediği gösterilmiştir. Sonuç olarak, GS-2 gen tedavisinin geliştirilmesinde CRISPR/Cas9 ile gen düzenleme ve LV vektörü ile gen ekleme karşılaştırılmıştır. Gen düzenleme yeterli düzeyde onarım yapmasına rağmen CRISPR aktarım teknolojisi hücre canlılığının düşürmektedir. LV gen aktarımı kolay ve etkindir ancak RAB27A'nın yüksek ifadesi kök hücre fonksiyonu etkilemektedir. Bu nedenle, her iki yöntem de GS-2 için gen tedavisine yönelik olarak geliştirilebilir, ancak bu tedaviler klinik kullanıma hazır olmadan önce yöntemlerin optimizasyonu, hücre canlılığının arttırılması ve ifade seviyelerinin tam olarak ayarlanması gerekli olabilir.
Özet (Çeviri)
Griscelli Syndrome Type 2 (GS-2) is caused by a mutation in RAB27A which plays a role in exocytosis and membrane trafficking, resulting in immune deficiency. Here, we investigated 1) the efficacy of CRISPR/Cas9 gene editing of RAB27A using GS-2 MSCs and iPSC lines; 2) the efficacy of LV vectors to transduce MSCs and express RAB27A under the control of the SFFV, PGK and UCOE promoters, and 3) potential risks related to overexpression of RAB27A in immune deficient mice. We designed CRISPR/Cas9 constructs that target mutations in RAB27A and tested the gene correction efficacy on GS-2 MSC and iPSC lines. We generated a new GS-2 iPSC line and optimized cell culture/cryopreservation. Although editing of RAB27A using CRISPR/Cas9 is possible, survival of the stem cells was low. Transduction of GS-2 MSCs with LV vectors showed the highest RAB27A expression with SFFV, followed by PGK and UCOE. RAB27A+ MSCs and HSCs were transplanted into immune deficient mice but did not cause tumor formation. However, RAB27A overexpression may affect stem cell function. In conclusion, we compared gene editing with CRISPR/Cas9 and gene adding with LV vectors for the development of gene therapy for GS-2. Although gene editing results in acceptable levels of repair, the technology results in low cell viability. LV gene transfer was easy and robust, but high expression of RAB27A affected stem cell function. Thus, both methods can be developed into gene therapy for GS-2, but optimization of the procedures, increasing cell viability and fine-tuning of expression levels may be necessary before these therapies are ready for clinical use.
Benzer Tezler
- Deprem riskinin bölgesel ve sektörel farklılaşma özelliklerine göre analizi-Tekirdağ örneği
The analysis of earthquake risk according to regional and sectoral differentiation characteristics-Sample of Tekirdag
ŞEYDA SAVAŞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Deprem Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiBilişim Uygulamaları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MUSTAFA TEVFİK ÖZLÜDEMİR
DR. ÖĞR. ÜYESİ HATİCE MELTEM GÜNDOĞDU
- Nsaı etkin madde içeren emüljel formülasyonlarının qbd yaklaşımıyla tasarlanması ve değerlendirilmesi
Design and evaluation of formulations contain nsai active pharmaceutical ingredient in emulgel form with qbd approach
GÜLŞEN YILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
Eczacılık ve FarmakolojiEge ÜniversitesiFarmasötik Teknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KEVSER ÖZGEN ÖZER
DOÇ. DR. NEŞE BUKET AKSU
- SMED ortamında çalışan maruziyetlerinin azaltılmasına yönelik bütünleşik bir metodoloji önerisi
An integrated methodology proposal for reducing worker exposure under SMED
HATİCE NİDA CİVAN
Doktora
Türkçe
2023
Endüstri ve Endüstri Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiEndüstri Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. EMRE ÇEVİKCAN
- On the aquatic toxicity of diverse chemicals: Development of novel In silico models towards selected aquatic organisms under the framework of reach regulation
Çeşitli kimyasalların sucul toksisiteleri: Reach mevzuatı çerçevesinde seçilmiş sucul organizmalara yönelik yeni modeller geliştirilmesi
SERLİ ÖNLÜ
Doktora
İngilizce
2018
KimyaBoğaziçi ÜniversitesiÇevre Bilimleri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MELEK TÜRKER SAÇAN
- Prenatal risk assessment of down syndrome by probabilistic classifiers
Olasılıksal sınıflandırıcılar ile down sendromunun doğum öncesi riskinin hesaplanması
ÖMER UZUN
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Bilgisayar Mühendisliği Bilimleri-Bilgisayar ve KontrolBoğaziçi ÜniversitesiBilgisayar Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. FİKRET GÜRGEN