Kırım Kongo Kanamalı Ateş virüsü kelkit suşu proteinlerinin ökaryotik hücrelerde stabil ifadesi
Stably expression of proteins of Crimean-Congo Hemorrhagic Aever virus kelkit strain in eukaryotic cells
- Tez No: 855508
- Danışmanlar: PROF. DR. MEHMET ZİYA DOYMAZ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 82
Özet
Kırım Kongo Kanamalı Ateşi (KKKA), insanlarda ciddi hastalığa neden olan zoonotik bir bulaşıcı hastalıktır. Bu hastalık özellikle vektör kenelerin endemik olduğu ülkelerde yüksek ölüm oranı ile karakterizedir. KKKAV'nün biyolojisi ve immunolojisine yönelik çalışmalarda viral proteinler diğer viral sistemde olduğu gibi büyük öneme sahiptir. KKKAV proteinlerinin çeşitli süreçlerdeki önemi birçok araştırmalarda ele alınmış ve bu çalışmalarda KKKAV proteinleri genellikle geçici ifade sistemleri kullanılarak üretimi sağlanmıştır. Bununla birlikte, proteinlerin stabil ifadesi tüm çalışmalar için zaman içerisinde tutarlı ve güvenilir bir model olmaktadır. Bu yüksek lisans tez çalışmasında, insan hücrelerindeki glikozilasyon süreçlerini taklit edebilen ökaryotik hücre hatları kullanarak KKKAV glikoproteinlerinin ve nükleoproteinlerinin stabil ekspresyon ile sürekli bir şekilde üretilmesini amaçlanmıştır. Bunun için insan hepatoselüler hücre hatları (Huh-7), KKKAV proteinlerinin stabil ifadesinde kullanılmıştır. Hücrelerde seleksiyon için seçici antibiyotiklere olan dirençleri, MTT analizi ile değerlendirilmiştir. KKKAV NP, PreGn ve PreGc kodlayan plazmitler Lipofectamine® 3000 ve polietilenimine (PEI) gibi transfeksiyon ajanlarının yardımıyla hücrelere aktarılmıştır. KKKAV nükleoproteinlerini ve glikoproteinlerini kararlı bir şekilde ifade eden hücreler, antibiyotiklere dirençli olan kolonilerin seleksiyonu ile üretilmiştir. Hücrelerde transfekte edilen genin stabil ekspresyon için genoma entegrasyonunun tespiti, transfekte edilen KKKAV genlerine özgü primerler tasarlanarak polimeraz zincir reaksiyonu ile gerçekleştirilmiştir. Genomik düzeydeki doğrulamaların yanı sıra hücrelerdeki hedef proteinlerin ifadesi gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu, Western blot, enzim immünoanalizleri ve immunfloresan analizleri ile de test edilmiştir. Yapılan deneyler, KKKAV proteinlerinin stabil hücrelerde başarılı bir şekilde ifade edildiğini göstermiştir. Western blot analizi, stabil hücre hatlarında üretilen proteinlerin beklenen boyutta olduğunu ve antijenitelerini doğrularken, EIA analizi bunların antijenik özellikleri tekrar test edilmiştir. Ayrıca, immunofloresan yöntemle mikroskobik görüntüleme üretilen proteinlerin hücreler içindeki lokalizasyonunu ortaya koymuştur. Özetle, bu tez çalışmasında, stabil hücrelerde KKKAV'nün nükleoprotein ve glikoproteinleri başarılı bir şekilde üretilmiştir. Bu stabil hücre hatlarının, KKKAV 'nün biyolojisi, immunolojisi ve patojenezi üzerine daha detaylı araştırmalarda önemli araçlar olarak hizmet etmesi beklenmektedir; çünkü bu virüs, araştırılması gereken öncelikli patojenlerden biri olarak kabul edilmektedir.
Özet (Çeviri)
Crimean-Congo Hemorrhagic Fever (CCHF) is a zoonotic infectious disease that causes severe illness in humans. This disease is particularly characterized by a high mortality rate in countries where vector ticks are endemic. Viral proteins play a crucial role in the biology and immunology of CCHFV, similar to other viral systems. The significance of CCHFV proteins in various processes has been addressed in numerous studies, and in these investigations, CCHFV proteins are typically produced using transient expression systems. However, stable protein expression proves to be a consistent and reliable model for such studies over time. In this study, the aim was to continuously produce CCHFV glycoproteins and nucleoproteins by using eukaryotic cell lines that mimic glycosylation processes in human cells. Human hepatocellular cell lines (Huh-7) were employed for the stable expression of CCHFV proteins. The resistance of cells to selective antibiotics was evaluated through MTT analysis, followed by transfection using transfection agents such as Lipofectamine® 3000 and polyethyleneimine (PEI). Cells expressing CCHFV nucleoproteins and glycoproteins in a stable manner were generated through the selection of antibiotic-resistant colonies. The detection of the transfected gene in the cells was performed using real-time PCR specific to the transfected CCHFV genes. Additionally, the expression of proteins was tested through immunofluorescence microscopy, Western blot, and enzyme immunoassays. The experiments demonstrated the successful expression of CCHFV proteins in stable cells. Western blot analysis confirmed that the produced proteins in the stable cell lines were of the expected sizes, while enzyme immunoassay (EIA) analysis confirmed their antigenic properties. Furthermore, immunofluorescence microscopic analysis revealed the localization of the produced proteins within the cells. The successful expression of CCHFV proteins in stable cells was demonstrated. These stable cell lines are expected to serve as important tools in further detailed investigations on CCHFV, contributing to the understanding of the virus's biology, immunology, and pathogenesis, as it is considered one of the priority pathogens for research.
Benzer Tezler
- Kırım kongo kanamalı ateş virüsü kelkit suşu gc glikoproteininin ökaryotik ekspresyon sisteminde üretilmesi
Production of crimean congo hemorrhagic fever virus glycoprotein gc in eukaryotic expression system
FİLİZ GÜNEY
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyoteknolojiBezm-i Alem Vakıf ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MEHMET ZİYA DOYMAZ
- Tokat ve Kelkit havzası civarındaki illerde kene-kökenli Kırım Kongo Kanamalı Ateşi Virüsü'nün RT-PCR yöntemi ile teşhisi
Diagnosis of tick-borne Crimean Congo Haemorrhagic Fever Virus with Rt-PCR method in Tokat and the other cities of Kelkit basin
GÜL AYDOĞAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2008
BiyolojiGaziosmanpaşa ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ŞABAN TEKİN
- Kırım Kongo kanamalı ateş virüsü antijenik nükleoprotein üretilmesi ve sitotoksik etkilerinin araştırılması
The production of antigenic nucleoprotein of Crimean-Congo hemorragic fever virus and the research of its cytotoxic effects
DUYGU KIRKIK
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
BiyolojiFatih ÜniversitesiTıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. ESEN BAKHAUTDIN
YRD. DOÇ. DR. BAKYTZHAN BAKHAUTDIN
- Kırım-kongo kanamalı ateşi virusuna karşı monoklonal antikor üretimi ve karakterizasyonu
Production and characterization of monoclonal antibody against crimean-congo hemorrhagic fever virus
ALIREZA HANIFEHNEZHAD
Doktora
Türkçe
2022
BiyoteknolojiAnkara ÜniversitesiVeterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AYKUT ÖZKUL
- Kırım kongo kanamalı ateş virusunun insan ve hayvan kaynaklı hücre kültürlerinde mikroRNA yolaklarıyla ilgili anahtar protein ekspresyonu
MicroRNA pathways related key protein expressions of crimean-congo hemorrhagic fever virus infected human and animal cell cultures
KATALIN FÖLDES