SMA hastalığının tedavisinde kullanılmak üzere rekombinant SMN1 proteininin üretilmesi ve saflaştırılması
Production and purification of recombinant SMN1 protein for using in the treatment of SMA disease
- Tez No: 870525
- Danışmanlar: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR, DOÇ. DR. ESRA TOKAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Moleküler Tıp, Biotechnology, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 126
Özet
Spinal Musküler Atrofi, omurilikteki anteriyor horn hücrelerinin kalıcı bozulmasıyla oluşan kas zayıflığı ve atrofi olarak tanımlanan hastalıktır. 10000 doğumda bir çocuğu etkileyen otozomal resesif olan SMA, bebek ölümlerindeki en yaygın genetik nedendir. SMA hastalığı SMN1 genindeki defektlerle ortaya çıkmaktadır. SMA'nın, 4 tipi bulunmaktadır. Dünyada tedavi stratejileri oldukça kısıtlı ve çok pahalıdır. Bu tez çalışmasında rekombinant SMN1 proteini TAT peptidi ile birlikte oluşturulacaktır ve ilaç oluşturma potansiyeli in vitro olarak değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Yapılan çalışmalar 3 iş paketinden oluşmaktadır. İlk olarak, SMN1 geni pEGFP/N2 vektörü içerisinden restriksiyon enzimler ile kesilerek, pET-21a vektörüne klonlanmıştır. Bu klon SMN1-pET-21a olarak isimlendirildi. İkinci aşamada bu klonun yanına SMN1 proteininin hücre membranından geçişini sağlaması amacıyla hücre geçiş protein dizileri (TAT dizisi) klonlanmıştır. Bu klonun adı TAT-SMN1-pET21-a olarak isimlendirildi. Kontrol amaçlı boş pET-21a plasmidi kullanılmıştır. Tüm plazmitler E.coli BL21(DE)3 bakteri soylarına transforme edilmiştir. İkinci iş paketinde ise, E.coli BL21(DE)3 bakterileri IPTG ile indüklenmiştir. Ardından Ni-Nta yöntemiyle üretilen protein lizatından histidin kuyruğuna sahip TAT-SMN proteini saflaştırıldı. Saflaştırma Western blot ve SDS-Page ile doğrulanmıştır. dı. Üçüncü iş paketinde ise rekombinant protein aktivitesinin in vitro koşullarda etkisinin incelenmesi için SH-SY5Y hücrelerinde SMN1 gen ifadesi lentiviral pLKO1 plasmidi ile shRNA sistemi ile susturulmuştur. Tek koloni seçiminden sonra, elde edilen kolonilerde susturmanın gerçekleştiği, mRNA ve protein seviyesinde doğrulanmıştır. Ardından, saflaştırılan rekombinant protein farklı konsantrasyonda ve zamanlarda hücrelere uygulanmıştır. Rekombinant proteinin hücre canlılığına etkisi MTT analizi ile belirlenmiştir. Hücre içerisine girip girmediği immunofloresan tekniği kullanılarak belirlendi. Daha sonra, SH-SY5Y ve SMN1 ifadesi susturulmuş hücrelere farklı konsanstrasyonlarda rekombinant TAT-SMN proteini uygulanarak, hücrelerdeki SMN protein seviyeleri immunofloresan tekniğiyle belirlendi. Üretilen ilaç adayının in vitro aktivite deneylerinde başarılı olduğu belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
Spinal Muscular Atrophy is a disease characterized by muscle weakness and atrophy caused by permanent deterioration of the anterior horn cells in the spinal cord. Affecting one child in 10000 births, autosomal recessive SMA is the most common genetic cause of infant mortality. SMA is caused by defects in the SMN1 gene. There are 4 types of SMA. Treatment strategies are very limited and very expensive in the world. In this thesis study, recombinant SMN1 protein will be created together with TAT peptide and its drug-forming potential will be evaluated in vitro. The studies consist of 3 work packages. Firstly, SMN1 gene was cloned from pEGFP/N2 vector by restriction enzymes and cloned into pET-21a vector. This clone was named SMN1-pET-21a. In the second stage, cell transit protein sequences (TAT sequence) were cloned next to this clone to enable the SMN1 protein to pass through the cell membrane. This clone was named as TAT-SMN1-pET21-a. The empty pET-21a plasmid was used as a control. All plasmids were transformed into E.coli BL21(DE)3 bacterial strains. In the second work package, E.coli BL21(DE)3 bacteria were induced with IPTG. TAT-SMN protein with histidine tail was then purified from the protein lysate produced by Ni-Nta method. Purification was confirmed by Western blot and SDS-Page. In the third work package, SMN1 gene expression in SH-SY5Y cells was silenced by lentiviral pLKO1 plasmid and shRNA system to examine the effect of recombinant protein activity under in vitro conditions. After single colony selection, silencing was confirmed at the mRNA and protein level. Then, the purified recombinant protein was applied to the cells at different concentrations and times. The effect of the recombinant protein on cell viability was determined by MTT assay. Whether it enters into the cell was determined using immunofluorescence technique. Then, SH-SY5Y and SMN1 expression silenced cells were treated with recombinant TAT-SMN protein at different concentrations and SMN protein levels in the cells were determined by immunofluorescence technique. The produced drug candidate was found to be successful in in vitro activity assays.
Benzer Tezler
- Koyunlarda paraziter kaynaklı karaciğer fibrozisinde immunhistokimyasal incelemeler
Immunhistochemical investigations in sheep with parasitary liver fibrosis
AYHAN AKGÜN
Yüksek Lisans
Türkçe
2015
Veteriner HekimliğiYüzüncü Yıl ÜniversitesiPatoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. FATMA İLHAN
- Deneysel hayvan modelinde oluşturulan akut mezenter iskeminin erken tanısında d-dimer, l-laktat, IFABP'ın yeri ve prognostik değeri
The value of L-laktat, D-di̇mer, ifabp levels in the early diagnosis of acute mesenteric ischemia in an experimental animal study
EMRE ÖNER
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2016
İlk ve Acil YardımAnkara ÜniversitesiAcil Tıp Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. MÜGE GÜNALP
- Development and experimental verification of the stiffness matrix of the hiphad haptic device
Hıphad haptık cihazının direngenlik matrisinin oluşturulması ve deneysel olarak doğrulanması
BARIŞ TANER
Yüksek Lisans
İngilizce
2015
Makine Mühendisliğiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüMakine Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. MEHMET İSMET CAN DEDE
- Anaerobic membrane bioreactors for cost-effective municipal water reuse
Evsel atıksuların anaerobik membran biyoreaktörler ile maliyet etkin olarak yeniden kullanımı
HALE ÖZGÜN
Doktora
İngilizce
2015
Çevre Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiÇevre Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CUMALİ KINACI
PROF. DR. JULES B. VAN LIER
- Bandwidth enhancement techniques for CMOS transimpedance amplifier
CMOS transferempedans kuvvetlendiricinin bant genişliği başarımını geliştirmeye yönelik teknikler
JAWDAT ABUTAHA
Doktora
İngilizce
2016
Elektrik ve Elektronik Mühendisliğiİstanbul Teknik ÜniversitesiElektronik ve Haberleşme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. METİN YAZGI