SMA hastalığının tedavisinde kullanılmak üzere rekombinant SMN1 proteininin üretilmesi ve saflaştırılması
Production and purification of recombinant SMN1 protein for using in the treatment of SMA disease
- Tez No: 870525
- Danışmanlar: PROF. DR. FERAY KÖÇKAR, DOÇ. DR. ESRA TOKAY
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Moleküler Tıp, Biotechnology, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Balıkesir Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 126
Özet
Spinal Musküler Atrofi, omurilikteki anteriyor horn hücrelerinin kalıcı bozulmasıyla oluşan kas zayıflığı ve atrofi olarak tanımlanan hastalıktır. 10000 doğumda bir çocuğu etkileyen otozomal resesif olan SMA, bebek ölümlerindeki en yaygın genetik nedendir. SMA hastalığı SMN1 genindeki defektlerle ortaya çıkmaktadır. SMA'nın, 4 tipi bulunmaktadır. Dünyada tedavi stratejileri oldukça kısıtlı ve çok pahalıdır. Bu tez çalışmasında rekombinant SMN1 proteini TAT peptidi ile birlikte oluşturulacaktır ve ilaç oluşturma potansiyeli in vitro olarak değerlendirilmesi hedeflenmiştir. Yapılan çalışmalar 3 iş paketinden oluşmaktadır. İlk olarak, SMN1 geni pEGFP/N2 vektörü içerisinden restriksiyon enzimler ile kesilerek, pET-21a vektörüne klonlanmıştır. Bu klon SMN1-pET-21a olarak isimlendirildi. İkinci aşamada bu klonun yanına SMN1 proteininin hücre membranından geçişini sağlaması amacıyla hücre geçiş protein dizileri (TAT dizisi) klonlanmıştır. Bu klonun adı TAT-SMN1-pET21-a olarak isimlendirildi. Kontrol amaçlı boş pET-21a plasmidi kullanılmıştır. Tüm plazmitler E.coli BL21(DE)3 bakteri soylarına transforme edilmiştir. İkinci iş paketinde ise, E.coli BL21(DE)3 bakterileri IPTG ile indüklenmiştir. Ardından Ni-Nta yöntemiyle üretilen protein lizatından histidin kuyruğuna sahip TAT-SMN proteini saflaştırıldı. Saflaştırma Western blot ve SDS-Page ile doğrulanmıştır. dı. Üçüncü iş paketinde ise rekombinant protein aktivitesinin in vitro koşullarda etkisinin incelenmesi için SH-SY5Y hücrelerinde SMN1 gen ifadesi lentiviral pLKO1 plasmidi ile shRNA sistemi ile susturulmuştur. Tek koloni seçiminden sonra, elde edilen kolonilerde susturmanın gerçekleştiği, mRNA ve protein seviyesinde doğrulanmıştır. Ardından, saflaştırılan rekombinant protein farklı konsantrasyonda ve zamanlarda hücrelere uygulanmıştır. Rekombinant proteinin hücre canlılığına etkisi MTT analizi ile belirlenmiştir. Hücre içerisine girip girmediği immunofloresan tekniği kullanılarak belirlendi. Daha sonra, SH-SY5Y ve SMN1 ifadesi susturulmuş hücrelere farklı konsanstrasyonlarda rekombinant TAT-SMN proteini uygulanarak, hücrelerdeki SMN protein seviyeleri immunofloresan tekniğiyle belirlendi. Üretilen ilaç adayının in vitro aktivite deneylerinde başarılı olduğu belirlenmiştir.
Özet (Çeviri)
Spinal Muscular Atrophy is a disease characterized by muscle weakness and atrophy caused by permanent deterioration of the anterior horn cells in the spinal cord. Affecting one child in 10000 births, autosomal recessive SMA is the most common genetic cause of infant mortality. SMA is caused by defects in the SMN1 gene. There are 4 types of SMA. Treatment strategies are very limited and very expensive in the world. In this thesis study, recombinant SMN1 protein will be created together with TAT peptide and its drug-forming potential will be evaluated in vitro. The studies consist of 3 work packages. Firstly, SMN1 gene was cloned from pEGFP/N2 vector by restriction enzymes and cloned into pET-21a vector. This clone was named SMN1-pET-21a. In the second stage, cell transit protein sequences (TAT sequence) were cloned next to this clone to enable the SMN1 protein to pass through the cell membrane. This clone was named as TAT-SMN1-pET21-a. The empty pET-21a plasmid was used as a control. All plasmids were transformed into E.coli BL21(DE)3 bacterial strains. In the second work package, E.coli BL21(DE)3 bacteria were induced with IPTG. TAT-SMN protein with histidine tail was then purified from the protein lysate produced by Ni-Nta method. Purification was confirmed by Western blot and SDS-Page. In the third work package, SMN1 gene expression in SH-SY5Y cells was silenced by lentiviral pLKO1 plasmid and shRNA system to examine the effect of recombinant protein activity under in vitro conditions. After single colony selection, silencing was confirmed at the mRNA and protein level. Then, the purified recombinant protein was applied to the cells at different concentrations and times. The effect of the recombinant protein on cell viability was determined by MTT assay. Whether it enters into the cell was determined using immunofluorescence technique. Then, SH-SY5Y and SMN1 expression silenced cells were treated with recombinant TAT-SMN protein at different concentrations and SMN protein levels in the cells were determined by immunofluorescence technique. The produced drug candidate was found to be successful in in vitro activity assays.
Benzer Tezler
- Proliferatif vitreoretinopati tedavisinde doğal molekül olan apigenin kullanımının in vitro modelde araştırılması
Investigation of the use of apigenin, a natural molecule, in the treatment of proliferative vitreoretinopathy in an in vitro model
ÖZLEM KAYA
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2024
Göz HastalıklarıTrakya ÜniversitesiGöz Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. RÜVEYDE GARİP
- Polifenolik bileşiklerden resveratrol ve kurkuminin nörit boyu uzamasına etkisinin PC12 hücre hattında araştırılması
Investigation of the neurite outgrowth effects of resveratrol and curcumin in PC12 cell line
GAMZE BORA TATAR
Doktora
Türkçe
2012
Tıbbi BiyolojiHacettepe ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HAYAT YURTER
- SMA tedavisinde kullanılan risdiplam molekülünün kısa nükleik asit dizileriyle etkileşimlerinin hesapsal yöntemlerle incelenmesi
Computational investigation of the interactions of the risdiplam molecule used in SMA treatment with short nucleic acid sequences
GÜLDEN AYDIN
- Silikon implant çevresinde gelişen kapsül kontraksiyonunun önlenmesinde nintedanib ve pirfenidonun etkisi
The effect of nintedanib and pirfenidone on the prevention of capsular contracture surrounding the silicone implant
NİJAT BABAEV
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2022
Plastik ve Rekonstrüktif CerrahiAnkara ÜniversitesiPlastik Rekonstrüktif ve Estetik Cerrahi Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. BURAK KAYA
- Hepatit B virusunun ve tedavisinde kullanılan anti-viral ajanların konak DNA'sına olan genotoksik etkisi
The genotoxic effects of hepatitis B virus and the anti-viral agents used for its treatment to the host DNA
PINAR ÖZKAL
Yüksek Lisans
Türkçe
2004
Tıbbi BiyolojiAnkara ÜniversitesiTıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. HATİCE ILGIN RUHİ