Geri Dön

Atların EHV-1/4 enfeksiyonunun serolojik tanısı için in-House ELISA geliştirilmesi

Development of in-House ELISA for serological diagnosis of EHV-1/4 infection in horses

  1. Tez No: 871150
  2. Yazar: İLKER ŞAHİNKESEN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. SEVAL BİLGE DAĞALP
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Veteriner Hekimliği, Veterinary Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Ankara Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Veterinerlik Viroloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 108

Özet

EHV-1 ve -4, dünyada atçılık endüstrisinde ekonomik kayıplara neden olan atların önemli viral etkenleridir. Bu nedenle hastalığın tanısı, hastalığın önlenmesi ve kontrolünde çok önemlidir. Serolojik metotlar atların kan serumlarında EHV-1/4 spesifik antikor varlığı ve titresinin tespitinde kullanılmakta ve epidemiyolojik çalışmalarda populasyonun genel durumu hakkında bilgi verebilmektedir. Ayrıca aşılı hayvanlarda antikor varlığının/titresinin belirlenmesi; hayvanlarda reenfeksiyon oluşumu, virusun saçılımı, klinik tablonun şiddeti, maternal antikorların geçişinin sorgulanması hakkında bir fikir verebilmesi açısından oldukça önemlidir. Bu bilgilerden hareketle bu çalışmada, at Alphaherpesviruslarından dünyada yaygın olarak gözlenen ve önemli ekonomik kayıplara neden olan EHV-1/4 enfeksiyonlarının serolojik tanısı amacıyla bir in-house ELISA kitinin geliştirilmesi planlanmıştır. Bu çalışmayla EHV-1/4' e ait in-house ELISA kitinin üretilmesi ve her iki virus enfeksiyonunun hızlı serolojik tanısının yapılabilmesinin yanı sıra ticari kitlere bir alternatif olabilecek bir indirekt ELISA geliştirilmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla, her iki virus büyük hacimlerle üretilip, saflaştırıldıktan sonra protein miktarı tayin edilmiş ve ELISA pleytinin kaplanması amacıyla kullanılmıştır. Virusların titreleri hesaplandıktan sonra her iki virus yönünden yapılan virus nötralizasyon testinde (VNT) pozitif ve negatif serumlar belirlenmiş ve daha sonra ELISA kitinin geliştirilmesi aşamasında test edilmiştir. Söz konusu serumlarla yapılan VNT'de serumların %61,01'i (72/118) EHV-1, %79,66'sı (94/118) EHV-4 yönünden pozitif olarak tespit edilirken, serumların %60,26'sı (179/297) değerlendirilememiştir. Pozitif bulunan serumlara yapılan SN50 testleri sonucunda her iki virus için de ortalama antikor titresi 1/12 olarak hesaplanmıştır. In-house ELISA kitinin optimizasyonu, VNT ve ticari ELISA ile pozitiflikleri ve negatiflikleri kanıtlanan serumlarla yapılmıştır. Cut-off değerleri ise negatif kontrollere göre belirlendikten sonra tüm serumlar geliştirilen in-house ELISA kiti ile test edilmiştir. In-house ELISA ile kontrol edilen serumların %93,93'ü (279/297) EHV-1, %92,25'i (274/297) EHV-4, %91,91'i (273/297) ise EHV-1 ve -4'ün birlikte kullanıldığı ELISA için pozitiflik vermiştir. Bu sonuçlar VNT ile karşılaştırıldığında EHV-1/ELISA ve EHV-1/VNT arasında %57 spesifite, %100 sensitivite, EHV-4 ELISA ve EHV-4 VNT arası: %65 spesifite, %100 sensitivite olarak hesaplanmıştır. Ancak iki virus arasındaki kros reaksiyon göz önüne alındığında %75 spesifite, %100 sensitivite hesaplanmıştır. In-house ELISA sonuçları ticari ELISA ile karşılaştırıldığında ise; EHV-1 için %82, EHV-4 için %99 oranında benzerlik tespit edilmiştir. Aynı zamanda validasyon katsayısı hesaplamak için yapılan çalışmalarda pleyt bazında ortalama validasyon katsayıları (%C.V); EHV-1 için ilk pleytte %4,19, ikinci pleytte ise %3,75 olarak hesaplanmıştır. EHV-4 için ise ilk pleytte %3,01 ikinci pleytte %2,87 olarak hesaplanmıştır. Bu sonuçlar geliştirilen testlerin iyi şekilde valide olduğunu göstermektedir. Sonuç olarak EHV-1 ve EHV-4 arasındaki serolojik kros reaksiyon, tüm virus kullanılarak geliştirilen ELISA'ların her iki virusu ayrı ayrı tanıma potansiyelini sınırlamasına rağmen, atlarda yaygın olarak görülen ve ülkemizde aşılama ile kontrol altına alınmaya çalışılan EHV-1 ve/veya -4'e karşı oluşmuş antikorları tespit edilebilmesinin yanı sıra, VNT'de karşılaşılan olumsuzlukların (serumlarda var olan toksik etki, hücre gereksinimi, değerlendirmesinin uzun sürmesi, canlı virusa ihtiyaç vb. gibi) önüne geçebilmesi ve ticari ELISA ile sonuçların uyumu göz önünde tutularak tüm virus tespitini gerçekleştiren bu ELISA kitinin kullanılabilirliği ortaya konmuştur. İleride planlanacak çalışmalarla her iki virusa karşı oluşan antikorların ayrımını sağlayabilecek bir kitin geliştirilmesi de mümkün olabilecektir.

Özet (Çeviri)

EHV-1 and -4 are important viral agents of horses that cause economic losses in the horse industry around the world. Therefore, diagnosis of the disease is very important for preventing and controlling the disease. Serological methods are used to detect the presence and titer of EHV-1/4 specific antibodies in the blood serum of horses and can provide information about the general status of the population in epidemiological studies. Additionally, determining the presence/titer of antibodies in vaccinated animals; could give an idea about the occurrence of reinfection in animals, the shedding of the virus, the severity of the clinical picture, and the tranmission of maternal antibodies. Based on this information, in this study, it was planned to develop an in-house ELISA kit for the serological diagnosis of EHV-1/4 infection, which is one of the equine Alphaherpesviruses that is widely observed in the world and causes significant economic losses. With this study, it was aimed to produce an in-house ELISA kit for EHV-1/4 and to perform rapid serological diagnosis of both virus infections, as well as to develop an ab-ELISA that could be an alternative to commercial kits. For this purpose, after both viruses were produced in large volumes and purified, the protein amount was determined and used to coat the ELISA plate. After calculating the titers of the viruses, positive and negative sera were calculated in the virus neutralization test (VNT) performed for both viruses, and were then used in the development of the ELISA kit. As a result of VN assay, 61.01% (72/118) of the sera were detected positive in terms of EHV-1, and 79.66% (94/118) in terms of EHV-4, while 60.26% (179/297) of the sera could not evaluated. As a result of SN50 tests performed on positive sera, the average antibody titer for both viruses was calculated as 1/12. Optimization of the in-house ELISA kit was made with sera which positivity and negativity were proven by VNT and commercial ELISA. After the cut-off values were determined according to negative controls, all sera were tested with the developed in-house ELISA kit. The results of the sera that tested in-house ELISA; 93.93% (279/297) were EHV-1, 92.25% (274/297) were EHV-4, and 91.91% (273/297) were EHV-1/4 positive. These results were calculated as 57% specificity, 100% sensitivity between EHV-1/ELISA and EHV-1/VNT, and 65% specificity, 100% sensitivity between EHV-4 ELISA and EHV-4 VNT when compared to VNT. However, considering the cross-reaction between the two viruses, 75% specificity and 100% sensitivity were calculated. When in-house ELISA results are compared with commercial ELISA; A similarity rate of 82% was determined for EHV-1 and 99% for EHV-4. In studies conducted to calculate the validation coefficient, average validation coefficients (%C.V) on a plate basis; For EHV-1, it was calculated as 4.19% in the first plate and 3.75% in the second plate. For EHV-4, it was calculated as 3.01% in the first plate and 2.87% in the second plate. These results indicate that the developed tests are well validated. As a result, although the serological cross-reaction between EHV-1 and EHV-4 viruses limits the potential of ELISA tests developed using the whole virus to recognize both viruses separately, it is effective to detect antibodies produces against either EHV-1 or EHV-4, which is commonly seen in horses and is tried to be controlled by vaccination in our country. In addition to being able to detect formed antibodies, this ELISA kit performs the detection of all viruses by preventing the drawbacks encountered in VNT (such as the toxic effect in serum, the need for cells, the long duration of evaluation, the need for live virus, etc.) and the compatibility of the results with commercial ELISA, availability has been demonstrated. With future studies, it may be possible to develop a kit that can differentiate antibodies against both viruses.

Benzer Tezler

  1. At yetiştiriciliği işletmelerinde EHV-2 ve EHV-5 enfeksiyonlarının araştırılması ve tanısal EHV-5 real tıme PCR tekniğinin geliştirilmesi

    The investigation of EHV-2 and EHV-5 infections in stud farms and development of the diagnostic EHV-5 taqman real time PCR

    AYŞE ZEYNEP AKKUTAY

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2012

    Veteriner HekimliğiAnkara Üniversitesi

    Viroloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. FERAY ALKAN

    DOÇ. DR. KERSTİN BORCHERS

  2. Türkiye'de yarış atlarına ait genetik parametre tahminleri için rastgele regresyon ve reml yöntemlerinin karşılaştırılması

    A comparison of random regression and reml methods for genetic parameter estimates of racehorses in Turkey

    ÜMİT COŞKUN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    ZiraatOndokuz Mayıs Üniversitesi

    Zootekni Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HASAN ÖNDER

  3. Atların kastrasyonunda intratestiküler lidokainin akut faz yanıt ve cerrahi stres üzerine etkisi

    Effect of intratesticular lidocaine on acute phase response and surgical stress in horses' castration

    EYLÜL AKPINAR

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Veteriner HekimliğiAnkara Üniversitesi

    Cerrahi (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖMER BEŞALTI

  4. Dışkı bakılarına göre atlarda helmint enfeksiyonlarının genel durumu

    General condition of helminth infections in horses accordingto fecal examinations

    EMAN ABDALLA ADAM ABDALLATEEF

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    ParazitolojiAnkara Üniversitesi

    Parazitoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HIFSI OĞUZ SARIMEHMETOĞLU

  5. Risks in road transportation of horses

    Atların yol taşımacılığında riskleri

    ELNAZ TAGHIZADEH ALAMDARI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2019

    Ulaşımİzmir Ekonomi Üniversitesi

    Lojistik Yönetimi Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. BENGÜ OFLAÇ

    DOÇ. DR. AYSU GÖÇER