Geri Dön

A comparative study on immobilization of Jack Bean urease on different matrices

Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin değişik matrislere immobilizasyonu

PDF İndir

  1. Tez No: 874308
  2. Yazar: ABDULLAH SAİD OKUŞLUK
  3. Danışmanlar: DR. ÖĞR. ÜYESİ ABDULHALİM KILIÇ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 79

Özet

Birçok canlının yapısında bulunan üreaz enzimi, kararlı bir molekül olan üreyi çok kısa bir zaman diliminde karbon dioksit ve amonyağa parçalamaktadır. Azotlu bir metabolit olan üre, böbrek yetmezliği durumunda kan dolaşım sisteminden uzaklaştırılmalıdır. Tarımda aşırı üre gübresi kullanımı, azot döngüsünde ve ekosistemde bozulmalara yol açmaktadır ve ürenin yol açtığı toprak, su ve hava kirliliği ülke ekonomisi için büyük bir gider kalemi olmaktadır. Ayrıca, alkollü içki fermentasyonu esnasında üretilen kanserojen maddelerin öncülü olan üre, toplum sağlığı göz önünde bulundurularak zararsız maddelere dönüştürülmelidir. Bahsedilen etkenler dikkate alındığında üreaz enzimi, biyosensör, atık su arıtma sistemleri, yapay böbrek makineleri, kültürel mirasların restorasyonu, içecek endüstrisi, biyorejeneratif uzun mesafeli uzay yolculuğu ve tarım alanlarının rehabilitasyonunda yaygın olarak görev almaktadır. Fakat serbest üreaz enziminin tarım, endüstri ve tıp alanlarında kullanımı, enzimatik aktivitenin sıklıkla kaybıyla sonuçlanmaktadır. Ayrıca, enzimin devamlı veya ardışık kullanımı için izolasyon ve saflaştırma gibi yüksek maliyetli işlemlerin gerekliliği serbest üreaz enziminin bahsi geçen alanlara entegrasyonunu önemli ölçüde zorlaştırmaktadır. Bu tez, Jack Bean kaynaklı serbest üreaz enziminin immobilizasyonu ile geliştirilecek biyoteknolojik ürün aracılığıyla ekonomik, doğa dostu, kontrol edilebilir, zararsız ve sürdürülebilir bir projenin hayata geçirilmesini planlanmaktadır. Tezin temel amacı, üreaz enziminin farklı sistemlerde kullanılmak üzere en uygun bağlanma yüzeyi ve koşullarının bulunmasıdır. Bu kapsamda, bahsi geçen alanlarda kullanılmak üzere üre yıkımını gerçekleştirebilecek doğal biyokatalizör görevindeki üreaz enzimi, gıda sektörünün artık ürünleri olan biyouyumlu, doğada çözünebilen, toksik olmayan ve düşük maliyetli yumurta kabuğu ile soğan zarının yüzeyine immobilize edilmiş, bu sayede artık malzemelerin ekonomiye tekrar kazandırılması hedeflenmiştir. Yumurta kabuğu zarı, çapraz bağlı kollajenlerden oluşan esnek bir lif yapısı sunarken soğan zarının iç epidermisi ise çoğunlukla mikrofibriler selüloz içermektedir. Taramalı elektron mikroskobu ile görüntülenen doğal zarların, zayıf elektrostatik veya fiziksel etkileşimlere dayanan düşük maliyetli bir enzim immobilizasyon yöntemi olan adsorpsiyon için uygun niteliklere sahip olduğu gözlemlenmiştir. Jack Bean kaynaklı serbest üreaz enziminin immobilizasyonu için, doğal yüzeyler saf su ile yıkanmış, havayla kurutulmuş, eşit parçalar (1 cm2) halinde kesilmiştir. Elde edilen doğal yüzeylerin FDA (Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç Dairesi) onaylı polietilenimin ile yıkanarak pozitif yüklenmesi amaçlanmıştır. Bu sayede nötr koşullarda negatif net yüke sahip Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin pozitif yüklü yüzeylere adsorpsiyonu planlanmıştır. İdeal bağlanma koşullarının belirlenmesi amacıyla PEI uygulanan doğal yüzeylere farklı konsantrasyonlardaki üreaz enzimi immobilize edilmiş ve BCA (Bicinchoninic acid) testi aracılığıyla bağlanma verimleri hesaplanmıştır. BCA testi sonuçlarına göre en yüksek verimle bağlanma için 125 U/ml Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin yumurta kabuğu ve soğan zarlarına immobilize edilmesi gerekliliği anlaşılmıştır. Sonraki aşamalarda temel ölçüt enzim aktivitesi olmuş ve en iyi aktiviteyi elde etmek amacıyla optimizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Hem serbest hem de immobilize üreaz enzim aktivitesini belirlemek amacıyla reaksiyon sonucu üretilen amonyak miktarı, enzimatik aktivite göstergesi olarak belirlenmiştir. Bu amaçla kolorimetrik ve hassas bir yöntem olan Nesslerizasyon yöntemi optimize edilmiş ve Nessler maddesinin amonyağa olan hassasiyet aralığı spektrofotometrik ölçümler aracılığıyla tespit edilmiştir. Nessler maddesinin maksimum absorbans noktasını belirleme amacıyla 350-650 nm dalga boyu aralığında bir tarama yapılmış ve ideal ölçüm dalgaboyu 390 nm olarak belirlenmiştir. Bir sonraki adımda Jack Bean kaynaklı üreaz enzimine ait bütün aktif alanların üre ile doyurulduğundan emin olmak için serbest üreaz enziminin kinetik sabitleri belirlenmiştir. Enzim kinetiği deneyleri sonucunda ve Lineweaver-Burk yöntemi aracılığıyla serbest üreazın Michaelis sabiti (Km) 9.53 mM olarak hesaplanmıştır. Böylelikle 0.1 M ürenin substrat inhibisyonuna yol açmayacağı ve tüm aktif alanları dolduracağı anlaşılmıştır. İmmobilize edilmiş sistemlerde en yüksek enzim aktivitesini elde etmek amacıyla enzim bağlanması için hazırlanan yumurta kabuğu ve soğan zarları, farklı konsantrasyonlardaki PEI (%2.5, %5, %7.5, %10) ile yıkanmış ve değişen adsorpsiyon sürelerinde (1-6 saat) üreaz ile bağlanmıştır. Böylelikle, enzim aktiviteleri göz önünde bulundurularak ideal PEI konsantrasyonu ve adsorpsiyon süresi belirlenmiştir. En yüksek verimli Jack Bean kaynaklı üreaz aktivitesi, doğal yüzeylerin nötr pH ve oda sıcaklığı koşullarında, %5 (kütle/hacim) polietilenimin konsantrasyonu ile 3 saat boyunca yıkanması ile elde edilmiştir. En yüksek aktiviteye sahip immobilize Jack Bean kaynaklı üreaz sistemi pH, sıcaklık, reaksiyon tekrarı, raf ömrü ve ağır metal inhibisyonu gibi farklı koşullar ile test edilmiştir. Yumurta kabuğu ve soğan zarın bağlanan Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin değişen pH değerlerine karşı kararlılığının arttığı gözlemlenmiştir. Soğan zarına bağlanma ile 7.2 olan ideal reaksiyon pH'ı 0.6 birim bazik alana yönelmiştir. Yumurta zarına immobilze edilen üreazın ise optimum reaksiyon pH değerinde serbest enzimle karşılaştırıldığında bir değişiklik belirlenmemiştir. Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin ideal reaksiyon sıcaklığı, soğan zarına bağlanma ile 57.5 oC'den 64 oC'ye yükseltilmiştir. Diğer yandan ise yumurta kabuğu zarı yükselen sıcaklıkla birlikte parçalanmaya başlamış ve sıcaklık karşısında yapısı bozulmuştur. Serbest üreazın tekrar eden reaksiyonlarda kullanımı için izolasyon ve saflaştırma işlemleri gerekirken adsorpsiyon işlemiyle enzimin yeniden kullanılabilirliği bu tezin kapsamında arttırılmıştır. Yumurta kabuğu zarına bağlanma sonrasında 4 reaksiyon sonrasında üreaz aktivitesi yarılanmıştır. Bir diğer yandan, soğan zarına üreaz bağlanması ile bu değer 2 reaksiyon olarak belirlenmiştir. Enzim adsorpsiyonu ile serbest üreazın raf ömründeki gelişme de ayrıca bu tez kapsamında test edilmiştir. İmmobilize edilen Jack Bean kaynaklı üreaz enzimi potasyum fosfat tampon çözeltisinde veya kuru ortamda +4 oC'de saklanmıştır. Haftanın her günü yumurta kabuğu ve soğana bağlanan üreazın aktivitesi test edilmiştir. İmmobilize edilen ve potasyum fosfat tampon çözeltisinde saklanan üreaz enzimi bağlanma yüzeyi fark etmeksizin bir hafta sonunda aktivitesinin yarısını kaybetmiştir. Bir diğer yandan, yumurta kabuğu ve soğan bağlanan kuru saklama koşullarında bekletilen üreaz enziminin aktivitesinde bir hafta geçmesine rağmen herhangi bir düşüş gözlemlenmemiştir. Serbest üreazın immobilizasyon ile ağır metal inaktivasyonuna karşı göstereceği aktivite bakır, demir, çinko, kobalt, nikel, manganez ve kadmiyumun tuzları kullanılarak test edilmiştir. Yapılan deneyler sonucunda 8 nM bakır iyonunun serbest Jack Bean kaynaklı üreaz enzimini tamamen inhibe ettiği gözlemlenmiştir. Bu deney doğrultusunda, serbest üreaz enziminin adsorpsiyonu ile ağır metallere karşı göstereceği tepki bakır tuzu model alınarak ölçülmüştür. Daha önce serbest üreaz enzimini tamamen inaktivasyonuyla sonuçlanan 8 nm bakır iyonunun immobilizasyon sonucu üreaz aktivitesinde yalnızca %5'lik bir düşüşe neden olduğu analiz edilmiştir. Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin immobilizasyonu ile geliştirilen biyoteknolojik ürün, her ne kadar enzimin yeniden kullanılabilirliğini, ağır metal direncini, saklama kapasitesini ve çalışma kararlılığını önemli ölçüde arttırmış olsa da immobilize edilen Jack Bean kaynaklı serbest üreazın Michaelis sabiti (Km) her iki bağlanma yüzeyi için de önemli ölçüde artış göstermiştir. Serbest üreaz enzimi için 9.53 mM olarak hesaplanan Michaelis sabiti, yumurta kabuğu zarına adsorpsiyon ile 101.38 mM ve soğan zarına bağlanma ile 199.16 mM olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak, tez kapsamında yumurtası kabuğu ve soğan zarlarının yüzeylerine bağlanan serbest Jack Bean kaynaklı üreaz enziminin ilk defa karşılaştırmalı analizi yapılmış ve literatüre kazandırılmıştır. İmmobilize edilen üreaz enziminin ilk defa doğada uygulanabilirliği model sistemler üzerinden test edilmiştir. Ayrıca, enzim adsorpsiyonu için gereken en etkili bağlanma koşullarının tarım, tıp ve sanayide uygulanabilirliği, bu alanda ihtiyaç duyulan biyoteknolojik gelişmelere zemin oluşturmuştur. Geliştirilen sistemin yapay böbrek makinelerinde, su kalitesinin belirlenmesinde, kan üre ölçümünde, kültürel mirasların restorasyonunda ve sürdürülebilir uzay tarımında kullanımı hedeflenmektedir.

Özet (Çeviri)

Biotechnological applications of urease enzyme prevalently involve biosensor development, wastewater treatment systems, artificial kidney machines, restoration of cultural heritages, beverage industries, bioregenerative long-distance space travel systems and rehabilitation of agricultural fields. However, the integration of free urease to industrial, medical, or agricultural applications results in considerable drawbacks, such as activity loss in process conditions and high cost of isolation and purification for reuse. To overcome these mentioned restrictions and develop new biotechnological products, in this thesis study, we immobilized soluble urease onto the eggshell membrane and inner epidermis of the onion bulb scale. Natural supports for the immobilization of Jack Bean urease are already available as waste products of the food sector, with materials that are biocompatible, biodegradable, non-toxic and low-cost. Further, considering sustainability and feasibility issues, the eggshell and onion membranes were chosen for this approach. The eggshell membrane is essentially made of cross-linked collagens as a flexible protein fiber. Additionally, the inner epidermis of the onion bulb scale is predominantly composed of microfibrillar cellulose. The surface morphology of these natural membranes, as displayed by SEM imaging, provided a suitable support for the adsorption technique. This method is the simplest, undemanding, and economically attractive enzyme immobilization approach, relying on weak electrostatic interactions or physical bonding. For the immobilization of Jack Bean urease, each supportive membrane was initially washed with water, air-dried, and cut into 1 cm2 pieces. Subsequently they were treated with branched polyethyleneimine to generate polycationic surfaces. This adsorbent is generally recognized as an FDA-approved safe substance. The urease activity was detected by measuring the amount of released ammonia, as an indicator of residual urease activity. This measurement was performed spectrophotometrically at 390 nm using a colorimetric, specific and sensitive direct Nesslerization method. Based on the optimization experiments, it was found that Jack Bean urease was most successfully adsorbed onto the membranes after 3 hours of treatment with 5% (w/v) polyethyleneimine at neutral pH at room temperature. Reusability studies indicated that the immobilized urease could be reused for 5 reactions with a 50% loss in its original activity. The urease adsorbed onto the onion membrane, when kept in dry storage at 4 oC, remained fully active for a week. This promised a considerable improvement in storage capacity compared to free enzyme. While the optimum reaction temperature for the soluble enzyme was determined as 60 oC, the immobilization of urease onto the onion membrane broadened the optimum temperature range to 50-80 oC. The optimum reaction pH for soluble urease was 7, but the pH optima for the adsorbed urease onto the onion membrane shifted towards the basic side, displacing through 1 unit. Metal ion inactivation of copper, iron, zinc, cobalt, nickel, manganese, and cadmium towards free urease was assayed, and it was noticed that 8 nM of copper ions completely inactivated the free enzyme. However, by adsorbing soluble urease onto the eggshell and onion membrane, only approximately 5% loss in enzymatic activity was observed at the same concentration of copper ion. Despite the advanced reusability, heavy metal resistance, storage capacity and operational stability provided by the immobilization of Jack Bean urease, Km value increased approximately ten times compared to the Michaelis constant of soluble Jack Bean urease.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    798977

    Grubbs katalizörlerinin amin fonksiyonlu polistiren desteğe immobilizasyonu ve olefin metatez tepkimelerindeki aktivitelerinin ve etkinliklerinin karşılaştırmalı olarak incelenmesi

    Immobilization of grubbs catalysts on amine-functionalized polystyrene supports and comparative investigation of their activity and efficiency in olefin metathesis reactions

    KELİME ERDEM

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    KimyaHacettepe Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. BÜLENT DÜZ

  2. Tez No

    735811

    Schıff bazı metal kompleksi immobilize edilmiş kopolimer kaplı grafit elektrotların elektrokatalitik aktivitelerinin incelenmesi

    Investigation of the elektrocatalytic activities of schife some metal complex immobi̇li̇zed copolymer coated graphite electrodes

    ÖZLEM DEMİR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    KimyaHatay Mustafa Kemal Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. DİDEM ÇAKMAK

  3. Tez No

    286084

    Development of a sandwich-type dna array platform for the detection of label-free oligonucleotide targets

    İşaretsiz hedef oligonükleotidlerin tayini için sandviç tabanlı DNA dizi platformunun geliştirilmesi

    SENA CANSIZ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Bölümü

    PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

    YRD. DOÇ. DR. CAN ÖZEN

  4. Tez No

    503018

    Sıçanlarda donuk omuz modelinde, eklem içi kortikosteroid ve trombositten zengin plazma enjeksiyon etkilerinin karşılaştırılması

    Comparative efficacy of corticosteroid and platelet rich plasma intraarticular injection on the adhesive capsulitis of rats

    JAVID MOHAMMADZADEH AZARABADI

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    Ortopedi ve TravmatolojiBaşkent Üniversitesi

    Ortopedi ve Travmatoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ORÇUN ŞAHİN

  5. Tez No

    266936

    Wistar Albino sıçanlarda strese bağlı mukoza hasarının tedavisinde maydanoz. beta karoten, melatonin, askorbik asit ve lansoprazolün etkilerinin karşılaştırmalı olarak incelenmesi

    Investigation of the comparative effects of parsley, beta-carotene, melatonin, ascorbic acid and lansoprazole on the treatment of mucosal injury induced by stress in Wistar Albino rats

    AYŞİN AKINCI

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2010

    Histoloji ve Embriyolojiİnönü Üniversitesi

    Histoloji ve Embriyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUKADDES EŞREFOĞLU

Geri Dön