Geri Dön

Development of a sandwich-type dna array platform for the detection of label-free oligonucleotide targets

İşaretsiz hedef oligonükleotidlerin tayini için sandviç tabanlı DNA dizi platformunun geliştirilmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 286084
  2. Yazar: SENA CANSIZ
  3. Danışmanlar: PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM, YRD. DOÇ. DR. CAN ÖZEN
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Biotechnology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2010
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: Orta Doğu Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Biyoteknoloji Bölümü
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 99

Özet

DNA tabanlı mikrodiziler günümüzde sıklıkla kullanılan biyoanalitik yöntemlerin başını çekmeye adaydır. Genetik hastalıkları tayin etmek için kullanılan DNA tabanlı mikrodizi platformları, değişik yüzeyler kullanılarak oluşturulmaktadır. Günümüzde tanı amaçlı kullanılan aletlerin çok pahalıya malolmasının sebebi kendine özel donanıma sahip olmasıdır. Bu çalışmada, işaretsiz hedef nükleik asitleri tespit etmek amacıyla sandviç hibridizasyonu formatında dizi platformu geliştirilmesi üzerine çalışılmıştır.Sandviç hibridizasyonu direk hibridizasyondan farklı olarak, işaretlenmemiş hedef oligonükleotidi tespit edebilmekte, tanı maliyetini azaltmakta ve tanı süresini kısaltmaktadır. Sekans spesifik sinyalini geliştirmek için sandviç hibridizasyon dizi platformu, yüzeye sabitlenmiş birinci DNA dizisinden (prob1) ve florasan ile işaretlenmiş olup, hedeflenen oligonükleotitin kısmen tamamlayıcı bazları bulunmakta olan ikinci DNA parçacığından (prob2) oluşmaktadır.Mikrodizi platformunda sekansların yüzeye sabitlenmesi için hem 3-aminopropil-3 metoksi silan(APTMS) hem de piyasada satılan poli-L- lizin kaplı cam slaytlar(lamlar)kullanılmıştır. Poli-L-lizin kaplı cam slaytlar(lamlar) kullanıldığında daha az arka plan sinyali elde edildiğinden bu yüzey tipi tercih edilmiştir.İlk DNA dizisini (Prob 1) yüzeye sabitlemek için iki farklı yöntem kullanılmıştır. Birinci yöntemde yüksek ısı kullanılarak DNA dizileri yüzeye tutturulmaya çalışılırken, ikinci yöntemde çapraz bağlayıcı yardımı ile diziler yüzeye sabitlenmeye çalışılmıştır. Yapılan deneylere ışığında çapraz bağlayıcı yöntemi ile DNA dizilerini yüzeye sabitlemenin negatif kontrollerdeki pozitif sonuçları ortadan kaldırmak suretiyle daha etkili bir yöntem olduğu belirlenmiştir.Yüzey seçimi ve DNA parçaçıklarını yüzeye bağlama methodu seçildikten sonra çapraz bağlayıcı çeşidi, DNA problarının konsantrasyonu, platformun hassasiyeti ve hibridizasyon koşullarını (sıcaklık, sekans sırası ve süre) belirlemek amacıyla karşılaştırmalı optimizasyon deneyleri yapılmıştır. Bu deneyler sonucunda, elde edilen verilere gore en iyi hibridizasyon sinyali 35° C'de, 32,5 ? çapraz bağlayıcı uzunluğunda, 10 ?M platform hassasiyetinde ve 20 ?M sinyal prob konsantrasyonunda elde edilmiştir. Son olarak, çip sisteminin hedeflenen DNA dizisine özel olup olmadığını test etmek için farklı dizideki DNA sekansları platform uygulandı. Sonuç olarak geliştirilen makrodizi sisteminin sadece hedeflenen DNA dizisine spesifik olduğu gözlemlenmiştir.

Özet (Çeviri)

DNA arrays have become a major bioanalytical method as they enable high-throughput screening and they can be manufactured on different surfaces depending on the nature of diagnostic purpose. However, current technologies to produce and detect arrays of DNA probes are expensive due to the requirement of specialized instrumentation. In this study we have established an array platform in sandwich hybridization format for the detection of label-free nucleic acid targets.Unlike direct hybridization, which is the main microarray hybridization principle, sandwich assay enables unlabeled target detection, lowering the cost and assay time. To this end, sequence specific signal development was achieved by a sandwich complex which is composed of a surface immobilized capture DNA probe (Probe1) and a fluorescein-tagged signal DNA probe (Probe 2), which are partially complementary to the sequence to be analyzed (target oligonucleotide).As the solid support of the array platform both 3-aminopropyl-3-methoxysilane (APTMS) activated and commercially purchased poly-L lysine coated glass slides were used and due to the less background noise property the latter one was preferred.Similarly, for the immobilization of the capture Probe (P1) onto the solid support two different methods were tried; heat immobilization and immobilization via a heterobifunctional cross-linker (HBCL). In regard to the experiments, it is observed that using a cross-linker instead of heat immobilization reduces the ratio of false negative control results in a significant manner.Following the solid support and immobilization method choice comparative optimization studies which include cross-linker type, probe concentration, sensitivity of the platform and hybridization conditions (sequence, temperature and duration) were conducted. Optimum hybridization signal was obtained with a 32.5 ? cross-linker, 10 ?M capture and 20 ?M signal probe concentrations at 35°C.Finally, in order to evaluate the specificity of the array system a cocktail of target DNA were applied to the system on which different capture probes of those target DNAs were immobilized. The results indicated that the optimized array system is specific enough to detect only the target oligonucleotide yet the unspecific ones.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    286091

    Development of an oligonucleotide based sandwich array platform for the detection of transgenic elements from plant sources using label-free PCR products

    İşaretlenmemiş PZR ürünlerini kullanarak bitkilerden transgenik elementlerin tespiti için oligonukleotit tabanlı sandviç dizi platformunun geliştirilmesi

    FATMA GÜL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2010

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Bölümü

    DOÇ. DR. FÜSUN İNCİ EYİDOĞAN

    PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

  2. Tez No

    385098

    Generation of aptamer against Salmonella serovar enteritidis and development of aptamer-based capillary biosensor

    Salmonella enteritidis'e karşı aptamer seçimi ve aptamer tabanlı kapiler biyosensorün geliştirilmesi

    CEREN BAYRAÇ

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2014

    BiyoteknolojiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. HÜSEYİN AVNİ ÖKTEM

    PROF. DR. FÜSUN EYİDOĞAN

  3. Tez No

    305161

    Development of high fill factor and high performance uncooled infrared detector pixels

    Yüksek etkin alanlı ve yüksek performanslı soğutmasız kızılötesi detektörlerinin geliştirilmesi

    ŞENİZ ESRA KÜÇÜK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2011

    Elektrik ve Elektronik MühendisliğiOrta Doğu Teknik Üniversitesi

    Elektrik ve Elektronik Mühendisliği Bölümü

    PROF. DR. TAYFUN AKIN

  4. Tez No

    477805

    Kanser biyomarker'larına yönelik elektronano tanı platformlarının geliştirilmesi

    Development of electronano diagnostic platforms for cancer biomarkers

    DORUKHAN KALYONCU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2017

    KimyaMuğla Sıtkı Koçman Üniversitesi

    Kimya Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ÜLKÜ ANIK

  5. Tez No

    747479

    Kronik yaralar için 3B basılmış kontrollü ilaç salım sisteminin tasarımı ve geliştirilmesi

    Design and development of 3D-printed controlled drug release system for chronic wounds

    SENA HARMANCI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    BiyomühendislikYıldız Teknik Üniversitesi

    Biyomühendislik Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. CEM BÜLENT ÜSTÜNDAĞ

    DR. SÜMEYYE CESUR

Geri Dön