Geri Dön

Chronological lifespan analysis of stress-resistant yeasts

Strese dirençli mayaların kronolojik yaşam sürelerinin analizi

PDF İndir

  1. Tez No: 876220
  2. Yazar: ASLI NUR AKAYDIN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 69

Özet

Tarihin en eski zamanlarından beri mayalanma, bira yapımı, ekmek ve şarap üretimi gibi süreçlerde geniş kullanım alanlarında yer bulan Saccharomyces cerevisiae mayası, insan yaşamında vazgeçilmez bir öneme sahiptir.1996'da genomunun dizilenmesinin ardından; hücre biyolojisi, biyoteknoloji, kanser ve yaşlanma çalışmaları gibi biyolojinin çeşitli alanlarında en iyi bilinen ve sık kullanılan model organizmalardan biri haline gelmiştir. Diğer model organizmalara kıyasla genetik manipülasyonun ve yetiştirme koşullarının kolay gerçekleştirilebilir oluşu onu elverişli bir heterolog protein ve ekonomik olarak değerli ürün fabrikasına dönüştürmektedir. Mayanın çok sayıda insan geniyle %30 oranda homoloji taşıması onu ökaryotik hücre metabolizması ve hastalık modellerini çalışmak için uygun bir platform haline getirmektedir. Biyoloji alanında çok sayıda önemli keşif, mayalar aracılığıyla sağlanmıştır. Hücre döngüsü kontrol noktalarının keşfi, ökaryotik transkripsyion mekanizması, telomerlerin keşfi ve otofaji mekanizması mayalarda keşfedilerek Nobel ödülü alan bazı çalışmalara örnektir. S. cerevisiae mayası, son zamanlarda biyoyakıt alanında da kendine yer bulduğundan, çok sayıda ülkede önemli bir ekonomik kaynak olarak kullanılmaktadır. Yaşlanma tüm canlı organizmaların paylaştığı ortak bir süreçtir ve genelde biriken hasar ve bozulmadan kaynaklanan çok sayıda metabolik ve fizyolojik değişimi kapsamaktadır. Gelişen teknoloji ve insan ömrünün her döneminde gelişen yaşam koşullarına rağmen, yüzyılın sonunda yaşlanan nüfusun toplam nüfusun beşte birine karşılık geleceği ve yaşlılıkla ilgili hastalıkların devletler üzerinde ağır bir sosyoekonomik yüke dönüşeceği tahmin edilmektedir. Yaşlanma sürecini insanlar üzerinde çalışmak, uzun süre gerektirmesinin yanı sıra, ekonomik ve etik nedenlerle de güçtür. Geniş yelpazedeki organizmalar benzer yaşlanma örüntülerini paylaşsa da yaşlanma çalışmalarında mayaların kullanımı, daha kısa yaşam döngüsü ve daha kolay büyüme kapasitesi gibi avantajları dolayısıyla elverişli ve doğru bir ökaryotik modeldir. Mayada yaşlanma çalışmak için kronolojik ömür uzunluğu (CLS) ve replikatif ömür uzunluğu (RLS) olmak üzere iki yaklaşım bulunmaktadır. CLS'te çoğunlukla besin azlığı ya da toksik metabolit birikimi dolayısıyla gelişmenin durağan fazına girerek bölünmeyi durduran maya hücrelerinin ömür uzunluğu analiz edilir. Buna karşın RLS, mayada bölünen hücrenin hasarlı materyali yavru hücrelere aktarmayıp kendinde tutması ve bölünmekte olan hücrenin canlılığı boyunca belirli sayıda hücre bölünmesi sayısına sahip olacağı prensibine dayanarak bir hücrenin ölmeden önce kaç hücre bölünmesi gerçekleştireceğini tanımlar. CLS analizi, özellikle hücrenin belli stres koşullarına cevabı ve bunlara karşı hayatta kalışını analiz etmede etkili olduğundan hücre döngüsü duraklayan G0 hücreleri için ideal bir model oluşturur. xxii Metabolik mühendislik, organizmanın metabolik süreçlerini ve ürün oluşumunu geliştirmek amacıyla var olan mekanizmaları değiştirmek ya da rekombinant DNA teknolojisini kullanarak yeni mekanizmalar oluşturmak için yararlanılan etkili bir biyoteknolojik yaklaşımdır. Klasik metabolik mühendislikte suşun metabolik, genetik ve fizyolojik özelliklerine yönelik bilgiler toplanır ve sonrasında hedeflenen fenotipi elde etmeye yönelik ilgili faktörlerde manipülasyonlar gerçekleştirilir. Buna karşın, bir tersine metabolik mühendislik yaklaşımı olan evrimsel mühendislikte, hedeflenen fenotipe laboratuvar ortamında sağlanan selektif koşullarla erişilir. Bu stratejiyle maya suşları, kültür sırasında artan düzeyde stres uygulaması aracılığıyla, belli stres koşullarına dirençli hale gelebilir ya da istenen molekülleri üretmeye başlayabilir. Hedeflenen fenotipe ulaştıktan sonra genom ya da transkriptomda gerçekleşen moleküler değişimleri belirlemek için genomik ya da transkriptomik analizler yapılır. CRISPR-Cas9 gibi daha ileri teknolojiler ile, değişime uğrayan genetik faktörler aynı dirençli fenotipi oluşturmak üzere yabanıl tip suşlara aktarılabilir. Bu çalışmada, daha önceden evrimsel mühendislik ile elde edilmiş olan, farklı streslere dirençli S.cerevisiae suşları CLS ve canlılık performansları açısından incelendi. Bu amaçla çalışmada, mayaların üretim verimliliği ya da canlılıklarını etkileyen antimisin, bor ve donma-erime stres faktörleri seçildi. Genel evrimsel mühendislik stratejisine paralel olarak, strese dirençli popülasyona erişilene dek suşlar stres faktörünün kademeli olarak arttırılması (antimisin ve bor stresi için bileşiğin besiyerindeki konsantrasyonu, donma-erime stresi için ise stres tekrar sayısı) aracılığıyla elde edildi. Önceden yapılan çalışmalarda evrimsel mühendisliğe tabi tutulan suşların diğer stres türlerine de çapraz dirençli olabileceği ya da evrimsel sürece bağlı olarak ömür uzunluklarının etkilenebileceği gösterilmiştir. Bu çalışmada, farklı stres türlerine direncin maya hücrelerinin CLS değerine ve dolayısıyla endüstriyel suşların kullanım ömürlerine olan etkilerini tespit etmek hedeflenmiştir. Bu amaçla kantitatif ve yarı-kantitatif CLS analizleri gerçekleştirilmiştir. Yarı-kantitatif CLS deneyinde kültürdeki maya suşlarının OD600 değerleri 6'ya sabitlendikten sonra suşlardan örnekler her iki günde bir seri dilüsyonlarla katı agar besiyerine yayılmıştır. Daha sonrasında strese dirençli suşun ömür uzunluğu kontrol suşuyla görsel olarak karşılaştırılmıştır. Sonuçlara göre donma-erime stresine dirençli poliploid endüstriyel P8 suşu, endüstriyel kontrol suşuna göre daha uzun ömürlü çıkmıştır. Antimisin ve bor stresine dirençli suşların ise, referans suşundan daha uzun ömürlü olmadığı görülmüştür. Çalışmanın ikinci kısmında uzun ömürlü P8 suşu, poliploid endüstriyel referans suşu R625 ve laboratuvar referans suşu 905 ile birlikte katı agar besiyerine yayılarak kantitatif CLS analizi gerçekleştirilmiştir. Uzun ömürlülük, koloni oluşturan birimlerin (CFU) sayılmasıyla tayin edilmiştir. Deney, deneyin başlangıcında %100 olarak kabul edilen kültür canlılığının %0.0001 değerine düşmesine dek tekrarlanmıştır. Deneyin ikinci kısmında da yarı-kantitatif CLS analizi sonuçlarını doğrulayacak şekilde P8, endüstriyel referans suşuna kıyasla daha uzun CLS performansı sergilemiş ve deneyin 10. gününe kadar canlılık göstermiştir. Bu çalışmanın sonucunda, test edilen çeşitli streslere dirençli suşlar arasında sadece donma-erime stresine dayanıklı P8 suşu daha uzun ömürlü bulunmuştur. Antimisin ve bor stresine dirençli suşlar referans suşlarına kıyasla uzun ömürlülük sergilememiştir. Daha önceki çalışmalarda donma-erime stres cevabının oksidatif stres cevabı ve besin metabolizması değişimleriyle ilgili olduğu gösterildiğinden bu çalışmanın sonucu da evrimsel mühendislik sürecinde bu tür yolaklarda meydana gelen benzer değişimlere xxiii bağlı olabilir. Bu çalışma kapsamında, farklı organizmalarda incelenmiş olsa da mayada bor stresine karşı direncin ömür uzunluğuna etkisi de ilk kez çalışılmıştır. Benzer şekilde antimisin direncinin ömür uzunluğuna etkisi mayada ilk kez bu çalışmada irdelenmiştir. İleriki çalışmalarda da, örnek olarak evrimsel mühendislikle kazanılan stres direncinin meydana getirdiği genomik ve transkriptomik değişimleri tanımlayacak araştırmalar gerçekleştirilebilir ve bu değişimler yabanıl tip suşlara aktarılarak bunların canlılık ve CLS profilleri analiz edilebilir.

Özet (Çeviri)

Saccharomyces cerevisiae has an important place in human life with its wide usage in various processes like fermentation, brewing, bread and wine production from the oldest times in history. Since its genome sequencing in 1996, it has become one of the most well-known and studied model organisms in many different areas of biology such as cell biology, biotechnology, cancer and aging research. Compared to other model organisms, its ease in genetic manipulation and cultivation conditions made it a convenient host for the production of heterologous proteins and economically valuable products. Yeast shares 30% of homology with many human genes, thus it is a convenient platform to study eukaryotic cell metabolism along with disease models. Aging is a common process all living organisms share and involves numerous metabolic and physiological changes that usually result from accumulated damage and deterioration. Despite the developed technology and improved living conditions through every passage of human life, it is estimated that the aging population will cover one-fifth of the whole population of the world by end of the century and agerelated diseases will cause a socioeconomic burden to governments. Studying aging in humans is complicated because of the long lifespan and economic and ethical concerns. Although a wide range of organisms share similar aging patterns, using yeast provides a convenient and accurate eukaryotic model with a shorter lifespan and easier growth capability. There are two main approaches to studying aging in yeast: chronological lifespan (CLS) and replicative lifespan (RLS). CLS seeks to analyze the lifespan of undivided yeast cells after they enter the stationary phase, mostly caused by decreased nutrients or toxic metabolite accumulation. RLS defines the number of cell divisions a cell undergoes before its death. CLS analysis is particularly useful for analyzing the response and survival of the cell against certain stress factors and modeling G0 cells that arrest their cell cycle. Metabolic engineering is an effective biotechnological approach for improving metabolic processes and product formation of the organism by altering the existing mechanisms or introducing new ones through the usage of recombinant DNA technology. In classical metabolic engineering, information on metabolic, genetic and physiological data of the strain is gathered, then the manipulations on relevant factors are employed to obtain the desired phenotype. Yet in the inverse metabolic engineering approach, for example when evolutionary engineering is employed, the desired phenotype is achieved using laboratory-based evolutionary settings. In this strategy, yeast strains can become resistant to certain stress factors or produce desired molecules throughout the increased stress treatment during culture. After obtaining the desired phenotype, yeast strains are examined by genomic or transcriptomic analyses to further determine the molecular changes in the genome or transcriptome. With more advanced xix technologies such as CRISPR-Cas9, altered genetic traits can be transferred to wildtype strains to evoke the same resistant phenotype. In this study, previously obtained stress-resistant S. cerevisiae strains were analyzed for their CLS and viability performances. Stress factors selected for this purpose were antimycin, boron and freeze-thaw stresses which can affect the production efficiency or viability of yeast strains. In parallel with the general evolutionary engineering strategy, strains were obtained by increasing the stress levels gradually, which is the concentration of the compound in the case of antimycin and boron, and repeat numbers in the case of freeze-thaw stress, in selection cultures until the resistant population is achieved. It was shown previously that the evolved strains could become crossresistant to other stress types or their longevity can be affected by the process. The aim of this study was to determine which type of stress resistances can extend or shorten the CLS of the yeast thus affecting the lifespan of the industrial and laboratory yeast strains. For this aim, both quantitative and semi-quantitative CLS analyses were carried out. In the semi-quantitative CLS experiment, OD600 values of the yeast strains were set to 6 before they were spotted onto agar plates every 2nd day with serial dilutions. The longevity of the resistant strains was compared with their control strains visually, based on the growth on the plates. According to the results, P8 which is the freeze-thaw stress-resistant, industrial polyploid strain had a longer CLS than its industrial reference strain, whereas the antimycin and boron-resistant strains did not have a longer CLS than their reference strain. In the second part of the study, quantitative CLS analysis was done by spreading the long-lived industrial P8 strain along with its industrial reference strain R625 and the laboratory reference strain 905 to agar plates. The longevity was measured by counting colony-forming units (CFUs). The experiment was repeated until the viability of the cultures was reduced to 0.0001% from day 0 of the experiment where the viability was accepted as 100%. In the second part of the study, further validating the results from the semi-quantitative analysis, P8 exhibited longer CLS compared to its industrial reference strain and could live until the 10th day of the experiment. Among the various stress-resistant strains tested in this study, only the freeze-thaw stress-resistant, industrial P8 strain was found to have a longer CLS. However, the antimycin and boron-resistant yeast strains did not show a longer CLS compared to their laboratory reference strain. Since the freeze-thaw response was previously associated with oxidative stress response and nutrient metabolism alterations, the longer CLS of the freeze-thaw stress-resistant industrial strain can be related to changes in respective pathways that originated from the evolutionary engineering process. In the scope of the research done for this study, despite being studied in other organisms, the effect of boron resistance on longevity was studied in yeast for the first time. Similarly, antimycin resistance was examined for its effect on longevity in yeast for the first time, as well. Further studies to analyze genomic and transcriptomic changes that occurred by the acquired resistance can be performed and these changes can be transferred to wild-type or reference strains to assess the viability and CLS profiles.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    770931

    Evolutionary engineering of rapamycin-resistant yeast

    Evrimsel mühendislikle rapamisine dirençli maya eldesi

    ÖMER ESEN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    511699

    Investigation of antimicrobial resistance in wild-type and stress-resistant Saccharomyces cerevisiae strains

    Yaban-tip ve strese dirençli Saccharomyces cerevisiae suşlarında antimikrobiyal dirençliliğinin incelenmesi

    RIZIQ NAHIDH ISMAEEL ALSAMAWI

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2018

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  3. Tez No

    496432

    Molecular and physiological investigation of longevity in yeast

    Maya hücrelerinde uzun yaşamın moleküler ve fizyolojik yönden incelenmesi

    MEVLÜT ARSLAN

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2017

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  4. Tez No

    338868

    Investigation of aging (Chronological Life Span) in S. cerevisiae by systems biology approaches

    Mayada (S. cerevisiae) yaşlanma mekanizmasının (Kronolojik Yaşam Süresinin) sistem biyolojisi yaklaşımıyla incelenmesi

    ESRA BÖRKLÜ YÜCEL

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    BiyomühendislikBoğaziçi Üniversitesi

    Kimya Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. KUTLU ÜLGEN

  5. Tez No

    857658

    Yaşlanma-geciktirici farklı bitki ekstraktlarının Saccharomyces cerevisiae kronolojik yaşam uzunluğuna etkileri

    The effects of different aging-delaying plant extracts on chronological life span of Saccharomyces cerevisiae

    MÜMİN SARGIN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyolojiÇanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi

    Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ TÜLAY TURGUT GENÇ

Geri Dön