Geri Dön

Molecular and functional investigation of disease-associated cytoskeletal proteins protrudin and MYO1H

Hastalık ilişkili sitoskeletal proteinler protrudin ve MYO1H'nin moleküler ve fonksiyonel araştırılması

PDF İndir

  1. Tez No: 879718
  2. Yazar: ECE SELÇUK ŞAHİN
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoloji, Genetik, Biology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 128

Özet

Herediter Spastik Parapleji (HSP) özellikle alt ekstremitelerde görülen kas zayıflığı ve spastisite ile karakterize; nadir, kalıtsal ve ilerleyici nörodejeneratif bir hastalıktır. Genel olarak HSP patolojisi, kortikospinal yolaktaki aksonların distal uçtan başlayarak hücre gövdesine doğru ilerleyen dejenerasyonu olarak tanımlanmaktadır. HSP kalıtımsal olarak otozomal resesif, otozomal dominant, X kromozomuna bağlı ya da mitokondriyal geçiş gösterebilmektedir. Klinik bulguları doğrultusunda HSP, saf ve kompleks olmak üzere iki alt gruba sınıflandırılmaktadır. Saf HSP'de semptomlar alt ekstremitelerde zayıflık ve spastisite, idrar kesesi ilişkili bozukluklar, derin sensör kaybı ile sınırlıdır. Diğer taraftan kompleks HSP'de saf form belirtilerinin yanı sıra; nöbet, demans, serebellar ataksi, optik atrofi vb. nörolojik bozukluklar da görülebilir. Bu nedenlerden dolayı HSP'nin hem genetik hem de klinik olarak heterojen bir hastalık olduğu bilinmektedir. Dahası hastalığa neden olan şimdiye kadar tanımlanan 85 gen ve lokus ya da aynı gen üzerinde tanımlanmış farklı mutasyonlardan dolayı hastalığın başlangıç yaşı, semptomları, şiddeti ya da hastalığın ilerleyişi gibi birçok parametre farklılık gösterebilmektedir. Hastalığın ortaya çıkış mekanizmasının anlaşılmasında ya da tedavisinin belirlenmesinde nedensel genin tespiti büyük önem taşımaktadır. Şimdiye kadar HSP ile ilişkilendirilmiş 85 gen ya da lokus bulunmakla beraber tüm vakaların %50'sini SPAST (SPG4) ve ATL (SPG3) genlerindeki mutasyonlar oluşturmaktadır. Mutasyonlarının HSP'ye neden olduğu tespit edilmiş diğer genler tarafından kodlanan proteinlerin hücresel rollerine bakıldığında; çoğunun hücre içi taşınımın düzenlemesinde ve bu mekanizmada yer alan başlıca organel olan endoplazmik retikulumun (ER) morfogenezinde rol aldığı görülmektedir. Geri kalan HSP proteinlerinin mitokondriyal regülasyon, miyelinasyon, lipit biyosentezi ve nükleotid metabolizması gibi yolaklarda görev aldığı belirlenmiştir. Sunulan bu tez kapsamında HSP tanısı almış bir Türk ailede tüm ekzom sekanslama yöntemi ile nedensel aday gen ve mutasyonun tespiti ve de tanımlanacak mutasyonun olası hücresel etkilerinin araştırılması hedeflenmiştir. Bu çalışma iki kısımdan oluşmaktadır. Elde edilen tüm ekzom sekanslama verileri ilk olarak daha önce HSP ile ilişkilendirilen genler baz alınarak taranmış ve tüm hasta bireyler mevcut olup sağlıklı bireylerde bulunmayan ZFYVE27 geninde c.244G>A varyasyonu tespit edilmiştir. ZFYVE27 geni Protrudin olarak isimlendirilen ve ER membranında lokalize olan bir proteini kodlamaktadır. Protrudin; çift yönlü membran trafiği ve endozomların geri dönüşümünün düzenlenmesi, hücresel uzantıların oluşumu, ER'nin morfogenezinde tubuler yapının oluşumun düzenlenmesi, nöronal uzama, nörit büyümesi gibi hücresel mekanizmalarda görevlidir. ZFYVE27 geninin HSP ile ilişkili olarak literatüre ilk sunulması; bu gende tanımlanan farklı bir mutasyonun, HSP'de mutasyonlarına en sık rastlanan gen olan SPAST (SPG4) gen ürünü Spastin proteini ile ZFYVE27 gen ürünü Protrudin interaksiyonunu olumsuz etkilediğini gösteren çalışma ile olmuştur. Sonrasında yapılan çalışmalar söz konusu etkileşimde bozulma olmadığını, hatta Protrudinin hücresel rolü olan uzantı oluşturma yeteneğinde de önemli farklar olmadığı bildirilmiştir. İlk yayının yazarı ise kendi sonuçlarını savunmuştur. Takip eden çalışmalara da dahil edilen p.G191V mutasyonu literatürde bir tartışmaya sebebiyet vermiştir. Sözü edilen bu çalışmalar dikkate alınarak tezin ilk kısmında; tarafımızca tanımlanan HSP ile ilişkilendirilebilecek ikinci bir Protrudin mutasyonu olabileceğini düşündüğümüz, proteinde p.V82I amino asit dönüşümüne neden olan c.244G>A varyasyonunun; Protrudinin SPAST (SPG4) tarafından kodlanan Spastin ve ATL (SPG3) tarafından kodlanan Atlastin1 proteinleri ile olan interaksiyonları üzerindeki olası etkileri incelenmiştir. Protrudin, Spastin ve Atlastin1 proteinlerinin hücre içi lokalizasyonlarını incelediğimiz çalışma ile Protrudinin hem Spastin hem de Atlastin1 ile kolokalize olduğunu gözlemledik. P.V82I mutasyonunun etkisinin incelenmesine paralel olarak, Protrudin ve Spastin proteinlerinin hücre membranının hemen altında yoğunlaşmasından yola çıkarak hücre invazyon mekanizmasındaki olası iş birliği, proteinlerin fazla üretildiği ya da ekspresyonlarının baskılandığı koşullarda yara iyileştirme metodu ile incelenmiştir. Elde ettiğimiz sonuçlarımıza göre Protrudin ve Spastinin hücre invazyon mekanizmasında kooperatif rollerinin olduğu gösterilmiştir. p.V82I mutasyonunun etkisini incelemeye yönelik yapılan ko-immunopresipitasyon ve yakınsal bağlanma metodu ile söz konusu varyasyonun Protrudin-Spastin ya da Protrudin-Atlastin1 interaksiyonuna olumsuz etkilerinin bulunmadığı tespit edilmiştir. Buna ek olarak hücresel morfolojideki olası etki immunositokimya deneyleri ile araştırılmış ve oluşan hücresel uzantı sayısında anlamlı fark gözlemlenmemiştir. Daha detaylı analizlerin gerekliliği için çalışmamıza farklı aile bireylerinin katılımı sağlanmış dahil olan sağlıklı ve hasta bireyler ZFYVE27 varyasyonu bakımından taranmıştır. Ancak bir hasta bireyde söz konusu varyasyonunun bulunmayıp sağlıklı bir bireyde var olması, tüm ekzom dizileme verilerinin yeniden analiz edilmesi gerekliliğini ortaya koymuştur. Tezin ikinci kısmında tüm ekzom sekanslama verileri, HSP ilişkili gen olup olmamasına bakılmaksızın yeniden analiz edilmiştir. Analiz sonucunda tüm hasta bireylerde bulunan ve sağlıklı bireylerde bulunmayan 14 ortak nadir varyant tespit edilmiştir. İn silico araçların tahminleri ve mutasyon tespit edilen proteinlerin hücresel fonksiyonları değerlendirilerek ATAD3C, VPS16 ve MYO1H olarak isimlendirilen üç adet aday gen belirlenmiştir. Tespit edilen varyasyonlarının ailesel segregasyonları Sanger sekanslama ile incelenmiş ve yalnızca MYO1H geninde belirlenen c.2972_2974del mutasyonunun aile içinde tam penetrasyon gösterdiği bulunmuştur. Söz konusu mutasyon, proteinde p.992delGlu delesyonuna sebep olmaktadır. Proteinin C-terminaline yakın olan 992. pozisyondaki amino asit, proteinin üç boyutlu yapısının kazanılmasında önemli olan kuyruk homoloji bölgesi (tail homology domain- TH1) içerisinde kalmaktadır. Ek olarak proteinin C-terminali bir motor protein ailesi olan Miyozin1 ailesine mensup MYO1H'nin hedef vezikülüne bağlanmasından sorumlu olan bölgesidir. Tezin ikinci kısmı kapsamında türler arasında yüksek amino asit sekans benzerliği ve de Miyozin1 aile üyeleri arasında yüksek yapısal benzerlik gösteren bu bölgedeki mutasyonun etkisi HSP ilişkili hücresel mekanizmalarda incelenmiştir. Daha önce bahsedildiği gibi HSP'nin ortaya çıkışındaki hücresel patofizyoloji aksonal geri çekilmeye bağlı dejenerasyon ve özellikle ER yapısının doğru oluşturulamamasına bağlı olarak hücresel trafikte meydana gelen aksaklıklardır. Bu bağlamda MYO1H geninde tanımladığımız p.Glu992del mutasyonu nöronal morfoloji üzerindeki etkisi, embriyonik sıçan beyinlerinden elde edilen kortikal nöronlarda immunositokimya yöntemi ile incelenmiştir. Daha önce hücresel görevine yönelik çalışmaların literatürde var olmadığı MYO1H proteinin nöronlarda dallanma, primer proses ve sekonder minör proseslerin sayısında artışa neden olduğu, bunun yanı sıra söz konusu mutasyonu taşıyan MYO1H'nin aksonal dallanmada anlamlı bir fark yaratmadığı, primer ve sekonder proses sayısında ise yabanıl tip kadar etkili olmadığı tespit edilmiştir. Buna ek olarak mutasyonun TH1 bölgesindeki lokalizasyonu dolayısıyla proteinin üç boyutlu yapısını kazanamaması ya da hedef veziküle bağlanamayarak moleküler trafiği olumsuz etkilemesi böylelikle de ER üzerinde strese yol açması olası olarak düşünülmüş ve mutasyonun etkisinin ER stresi açısından değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Yine embriyonik sıçan nöronlarına hem yabanıl tip hem de mutant MYO1H fazla eksprese ettirilmiş ve ER ilişkili proteinlerden PDI, Ero1-Lα, IRE1α, CHOP seviyeleri karşılaştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar değerlendirildiğinde, yabanıl tip MYO1H'nin ekspresyonunun artırılmasının sözü edilen protein seviyelerinde anlamlı artışa sebep olduğu, mutant formun ekspresyonunun artırılmasının ise bu protein seviyelerinde belirgin bir değişime neden olmadığı tespit edilmiştir. Elde edilen tüm sonuçlar değerlendirildiğinde ilk olarak belirlenen ZFYVE27 geni üzerindeki p.V82I varyasyonunun, gen tarafından kodlanan Protrudin proteini ile Spastin ya da Atlastin1 etkileşiminde olumsuz bir etki yaratmadığı, benzer şekilde hücre morfolojisinde farklılığa neden olmadığı bulunmuştur. Buna ek olarak ekzom verilerinin yeniden analizi ile MYO1H geninde tanımlanan p.Glu992del mutasyonunun protein fonksiyonunda olumsuz etkiye sahip olduğu görülmektedir. Sunulan tez, literatürde hali hazırda hücresel düzeyde çalışma bulunmayan MYO1H proteinin fonksiyonuna yönelik ilk çalışma olmakla beraber tanımlanan mutasyon HSP ile ilk kez ilişkilendirilmiştir. Nöronal morfolojideki değişikliklerle ilişkili olarak elde edilen sonuçlar, HSP'nin ayrıntılı mekanik analizi için temel oluşturmuştur.

Özet (Çeviri)

Hereditary Spastic Paraplegia (HSP) is a rare, inherited and progressive neurodegenerative disorder characterized by muscle weakness and spasticity, especially in the lower extremities. In general, HSP pathology is defined as degeneration of axons in the corticospinal pathway starting from the distal end and progressing towards the cell body. HSP can be inherited as autosomal recessive, autosomal dominant, X chromosome-linked or mitochondrial. HSP is classified into two subgroups as pure and complex according to clinical findings. In pure HSP, symptoms are limited to weakness and spasticity in the lower extremities, bladder-related disorders, and deep sensory loss. In complex HSP, neurological disorders such as seizures, dementia, cerebellar ataxia, optic atrophy, etc. may be observed in addition to the symptoms of pure form. For these reasons, HSP is both clinically and genetically heterogeneous. Moreover, many parameters such as age of onset, symptoms, severity or progression of the disease may vary due to these heterogeneities. Identification of the causative gene has great importance for understanding the mechanism of the disease or providing a target molecule to be used for its treatment. Although there are 85 genes or loci associated with HSP so far, mutations in SPAST (SPG4) and ATL (SPG3) genes account for 50% of all cases. When the cellular roles of proteins encoded by other genes whose mutations have been found to cause HSP are analyzed, it is seen that most of them are involved in the regulation of intracellular transport and in the morphogenesis of the endoplasmic reticulum (ER). The remaining HSP proteins have roles in pathways such as mitochondrial regulation, myelination, lipid biosynthesis and nucleotide metabolism. Within the scope of this thesis, identification of the candidate causative gene and mutation by whole exome sequencing method in a Turkish family diagnosed with pure HSP and identification of the possible cellular effects of the mutation to be identified were aimed to be investigated. This study consists of two parts: The whole exome sequencing data were first screened for 80 loci or genes HSP-related so far. Among these genes, the c.244G>A (p.V82I) variation in the ZFYVE27 gene was detected in all patients but not in healthy individuals. ZFYVE27 gene encodes a protein called Protrudin which is localized in the ER membrane. Protrudin is involved in cellular mechanisms such as the regulation of bidirectional membrane trafficking and recycling of endosomes, formation of cellular extensions, regulation of tubular structure formation for ER morphogenesis, neuronal elongation, and neurite growth. In the first report in the literature associating the ZFYVE27 gene with HSP, the ZFYVE27 gene product Protrudin was identified as an interaction partner of Spastin protein encoded by the SPAST gene. In the same study, it was shown that a different mutation from what I detected in the family involved in this thesis disrupted this interaction between Protrudin and Spastin protein. The following studies from another group submitted objection to that study and revealed no significant differences between the effect of the wild type and mutant Protrudin for the interaction with Spastin and cellular protrusion capability which is the major cellular role of Protrudin. The authors of the first study answered to this objection and defended their results. These different results caused a debate about the relation of the ZFYVE27 gene to HSP. Considering these studies, in the first part of the thesis, the possible effect of the c.244G>A variation causing p.V82I amino acid substitution in the protein was examined for the interactions of Protrudin with Spastin and Atlastin1 proteins which are the most common two mutant proteins for HSP. First of all, I examined the intracellular localization of Protrudin, Spastin and Atlastin1 proteins endogenously, and observed that Protrudin co-localized with both Spastin and Atlastin1 proteins and distributed throughout the cell. In parallel with the investigation of the effect of p.V82I mutation, due to the close localization of Protrudin and Spastin proteins to the cell membrane, their possible cooperation in the cell invasion mechanism was investigated by wound healing method under conditions where the proteins were either overexpressed or knocked-down. Results identified that Protrudin and Spastin may have co-operative and synergistic roles in cell invasion mechanisms in addition to their individual roles. Moreover, for investigation of the effect of the mutation co-immunoprecipitation and proximity ligation assays were performed and they revealed that the p.V82I variation I identified did not disrupt the interaction of neither Protrudin-Spastin nor Protrudin-Atlastin1 proteins. Moreover, the possible effects on cellular morphology were investigated by immunocytochemistry and no significant difference was observed in the number of cellular extensions. Results implicated that Protrudin mutation did not have significant effect for HSP, and a more detailed analysis in the family was required. Subsequently, different family members including unaffected and affected individuals were persuaded for this study and they were screened for ZFYVE27 variation. Surprisingly, the presence of this p.V82I variation in an unaffected individual, but not in an affected individual required re-analysis of all exome sequencing data. In the second part of the thesis, all exome sequencing data was re-analyzed regardless of the identified HSP-associated genes. As a result of the analysis, 14 common rare variants were found in all affected and not detected in unaffected individuals. Three candidate genes named ATAD3C, VPS16 and MYO1H were identified by evaluating the predictions of in silico tools and cellular functions of the proteins. Familial segregations of the identified variations were analyzed by Sanger sequencing and complete family penetrance was found only for the c.2972_2974del mutation on the MYO1H gene. This mutation causes p.992delGlu deletion in the protein. The amino acid at position 992, which is close to the C-terminus of the protein, localizes within the tail homology domain (TH1) which is important for the 3D conformation of the protein. In addition, the C-terminus of the protein is the region responsible for the binding of MYO1H to its target vesicles. In the second part of the thesis, the effects of the mutation localized in the TH1 domain, which has high amino acid sequence similarity between species and high structural similarity between Myosin1 family members, were analyzed in HSP-related cellular mechanisms. As mentioned above, the cellular pathophysiology for the onset of HSP is degeneration due to axonal retraction and disruptions in cellular traffic, especially due to the failure to construct the ER structure accurately. In this context, the possible effects of p.Glu992del mutation in MYO1H gene on neuronal morphology was investigated in cortical neurons obtained from embryonic rat brains by immunocytochemistry. The overexpression of MYO1H protein, whose cellular function has not been previously studied in the literature, resulted in an increase in the number of axonal branching, primary processes and secondary minor processes in neurons. However, MYO1H carrying the mutation did not cause a significant difference in axonal branching and was not as effective as the wild type in the formation of primary and secondary processes. Furthermore, due to the localization of the mutation in TH1 domain, I speculated that the protein might not gain 3D structure or might not bind to target vesicles and, thus adversely affect the molecular trafficking, ultimately might cause ER stress. For this purpose, both wild type and mutant MYO1H have been overexpressed in embryonic rat neurons and the levels of ER-related proteins PDI, Ero1-Lα, IRE1α, CHOP were analyzed. The overexpression of the wild type MYO1H caused a significant increase these protein levels, while the overexpression of the mutant form did not. When all the obtained results were evaluated, it was found out that the p.V82I variation in the ZFYVE27 gene did not cause any different effect than that of wild type on the interaction of Protrudin with Spastin or Atlastin1 and similarly any difference on cellular morphology. Additionally, it was observed that the p.Glu992del mutation on the MYO1H gene impaired the protein's function. This presented thesis is the first study on the function of the MYO1H protein, which has not been studied at the cellular level in the literature, and the mutation identified has been associated with HSP for the first time. The results obtained related to changes in neuronal morphology have provided the basis for detailed mechanistic analysis of HSP.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    641112

    Spinal müsküler atrofi hastalarının fibroblast kültürlerinde mikrotübül stabilitesinin araştırılması

    Investigation of microtubule stability in fibroblast cultures of spinal muscular atrophy patients

    PELİN ZOBAROĞLU

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2020

    Tıbbi BiyolojiHacettepe Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ GAMZE BORA

  2. Tez No

    881939

    Molecular analysis of cortical malformation in mammalian cortex by using proteomics approaches

    Proteomik yaklaşımlar kullanılarak memeli korteksindeki kortikal malformasyonun moleküler analizi

    BERFU NUR YİĞİT

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2024

    GenetikKoç Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. NURHAN ÖZLÜ SICAKKAN

  3. Tez No

    883355

    Investigation of glucose metabolism on helicobacter-activated B cells

    Helicobacter-aktive B hücrelerinde glikoz metabolizmasının incelenmesi

    IŞILAY AKDAĞ

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    Allerji ve İmmünolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYÇA SAYI YAZGAN

  4. Tez No

    856771

    Investigation of the effects of phosphorylation of spastin on neuronal morphology

    Spastinin fosforilasyonunun nöronal morfoloji üzerindeki etkilerinin incelenmesi

    EZGİ SELÇUK

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ

  5. Tez No

    751081

    Investigation of the function of vinculin and its isoform in muscle cells

    Kas hücrelerinde vinkülin ve izoformunun incelenmesi

    HANDE KASAP CAN

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2022

    BiyoteknolojiAcıbadem Mehmet Ali Aydınlar Üniversitesi

    Medikal Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ZEYNEP ASLIHAN DURER

Geri Dön