Geri Dön

Investigation of the effects of phosphorylation of spastin on neuronal morphology

Spastinin fosforilasyonunun nöronal morfoloji üzerindeki etkilerinin incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 856771
  2. Yazar: EZGİ SELÇUK
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ
  4. Tez Türü: Yüksek Lisans
  5. Konular: Biyoloji, Biology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2023
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 79

Özet

Hücre iskeleti, hücre tipine göre değişmekle beraber; hücre şeklinin korunması, hücrenin hareket etmesi ve bölünmesi gibi görevlerde yer alan temel ve elzem bir yapıdır. Mikroflamentler (aktin filamentler), ara filamentler ve mikrotubuller hücre iskeletini oluşturan üç temel yapıdır. Aktin filamentler hücre hareketi ve hücrenin şeklinin korunmasında görev alırken kasların kasılmasında aktif rol oynar. Ara filamentler hücreler arası bağ oluşumunda görev alırken hücreye yapısal destek sağlar. Hücre iskeletini oluşturan üçüncü yapı olan mikrotubuller ise hücre içerisinde organellerin taşınmasını sağlayıp hücre bölünmesinde aktif görev alır. Ayrıca mikrotubuller farklılaşmış hücrelerde akson oluşumu gibi özelleşmiş süreçlerde rol oynarlar. Mikrotubullerin protein yapısını α-tubulin ve β-tubulin alt birimleri oluşturur. Bu alt birimler kovalent olmayan bağlarla birbirlerine bağlanarak heterodimerleri meydana getirir. Heterodimerler ise kuyruktan başa bir yapıda oluşarak silindirik mikrotubul yapısını oluşturur. Mikrotubuller kutuplu bir yapıya sahiptir ve negatif uçlar daha stabil iken pozitif uçlar daha az stabildir. Artı ve eksi uçlar tubulin alt birimlerinin eklenip çıkarılmasından da ayırt edilebilir; bu alt birimler pozitif uçlardan eklenirler. Alt birimlerin eklenip çıkarılması ise mikrotubullere dinamiklik sağlar. Bu özellik“dinamik instabilite”olarak adlandırılır. Polarize uçları dışında, mikrotubuller hücre içerisindeki aktivitelerine göre de stabil ve stabil olmayan iki farklı yapıda gözlemlenir. Stabil mikrotubuller nöronlar gibi özelleşmiş hücrelerde bulunurken stabil olmayan mikrotubuller hızlı bir şekilde oluşma ve bozulma gerektiren mitotik hücre bölünmesi gibi olaylarda gözlemlenir. Mikrotubuller nöronların akson ve dendritlerinde yoğun miktarda bulunur ve çeşitli aktivitelerde rol oynarlar. Ancak mikrotubullerin rol oynadığı bölgelere taşınması gerekmektedir ve bu taşıma için nöronlar kesilir. ATP'yi parçalayan ATPaz enzim ailesinden olan katanin, fidgetin ve spastin enzimleri mikrotubullerin kesilmesinde rol oynarlar. Kesilme işlemi sonucunda mikrotubuller nöronlar içerisinde daha kolayca yer değiştirebilir. Spastin geninin aktivitesi sinirler ve kaslarla ilişkilendirilmiştir. 616 amino asitten oluşan spastin proteinini SPG4 geni kodlar ve bu gen 17 ekzondan meydana gelir. Spastin proteinin kodlayan SPG4 geninde meydana gelen mutasyonlar, alt ekstremitelerde spastisiteye neden olan Hereditary Spastik Parapleji (HSP) ile ilişkilendirilmiştir. Spastin ATP'ye bağlanarak hekzamer yapısı oluşturur ve ATP hidrolizi sonucunda mikrotubullerin düzenlenmesinde görev alır. Farklı başlangıç kodonları sebebi ile, spastinin iki farklı M1 ve M87 izoformları bulunmaktadır. M1 izoformu kortikospinal yolda sentezlenilip HSP ile ilişkilendirilirken; M87 hem nöronral hem de nöronal olmayan hücrelerde sentezlenir. Mikrotubul dinamiklerinin düzenlenmesinde spastin temel bir rol oynar. Dendrit ve aksonların formasyonu ve işleyişi için spastin proteini önemlidir ve aksonların distal ucuna konumlanarak; aksonların büyümesini tetikler. Ayrıca, mitokondrinin nöronlar içerisinde taşınması da spastin aktivitesi doğrultusunda gerçekleşmektedir. Nöronlar elektriksel ve kimyasal sinyaller aracılığıyla bilgilerin iletilmesini sağlayan özelleşmiş ve bölünmeyen hücrelerdir. Bu özelleşmenin sonucu olarak merkezi sentrozomlar bulundurmaz. Tüm hücre iskeleti elemanlarına sahiptirler ve bu hücre iskeleti elemanlarından olan mikrotubuller akson uzaması, aksonal taşınım gibi nöronal morfolojinin gelişmesinde görev alır. Nöronların gelişmesi hipokampal nöronlar ile uzun dönemlerdir çalışılıp incelenmiştir ve beş aşamada kategorize edilmiştir. İlk aşamada nöronlar, nöral kök hücrelerden meydana gelir ve lamellipodia isimli uzantılarını oluşturmaya başlarlar. İkinci aşamada dendritik uzantılar oluşur. Üçüncü aşama ile beraber uzantılar beynin diğer bölgeleri ve diğer nöronlarla bağlantılar kurar. Uzantılardan diğer uzantılara göre 10 µm'yi ilk geçen, diğerlerinden daha hızlı büyüyerek aksonu oluşturur. Dördüncü evrede hücre bağlantı noktaları oluşur. Son evrede ise sinaptik bağlantılar bir dizi değişim geçirir; aktif olarak kullanılan sipanslar güçlenirken sık kullanılmayan sinapslar yok olur. Spastin proteini aksonal taşıma, nörit büyümesi, aksonal dallanma, sinaptik bağlantıların oluşması gibi hücresel fonksiyonlarda rol oynar. Spastinin hücresel fonksiyonlarının regülasyonunu anlamak rol oynadığı dinamik proseslerin anlaşılması için önem taşımaktadır. Yapılan bir çalışmada HIPK2'nin (Homeodomain-Interacting Protein Kinase 2) spastini 268. serin amino asidinden fosforile ederek spastinin proteozomal degradasyonunu önlediği böylece HIPK2-aracılı fosforilasyonun spastinin stabilitesini arttırdığı bulunmuştur. Bu çalışmadan yola çıkarak, spastinin post-translasyonel modifikasyonlarından biri olan fosforilasyon durumunun nöronal morfoloji üzerindeki etkisini incelemeyi amaçladık. Bunun için, spastinin 268. serin amino asidinden fosforile olmayan (nonphosphorylated-S268A) ve fosforilasyon durumunun sürekli olarak devam ettiği fosfomimetik (phosphomimetic-S268D) mutant formları kullanılarak, fosforilasyon durumunun nöronal morfoloji üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Spastinin bu iki farklı formu primer sıçan hipokampal nöronlarda aşırı eksprese ettirilerek nöronal morfolojideki değişiklikler, immünositokimya analiziyle incelenmiştir. 24. ve 48. saatte fikse edilip boyanan hücrelerde aksonal dallanma, minor işlem sayısı ve aksonal uzunluk gibi ölçümler yapılarak istatiksel analizler gerçekleştirilmiştir. arasında istatiksel olarak bir anlamlılık gözlemlenmemiştir. Aksonal dallanma ve minor işlem sayısı analizlerini gerçekleştirirken nöronal morfolojideki değişikliklerin daha iyi anlaşılması için nöronlar, akson uzunlukları 40-100 µm ve 100 µm'dan fazla olanlar olarak gruplandırılmıştır. Akson uzunlukları 40-100 µm arası olan nöronlara“erken evre 3”adı verilirken, akson uzunlukları 100 µm'dan fazla olan nöronlar“evre 3”olarak adlandırılmıştır. Erken evre 3 nöronlarda aksonal dallanma sayısında transfeksiyondan 24 saatte sadece S268A ve kontrol grubu arasında fark gözlemlenirken, diğer gruplar arasında istatiksel olarak bir fark gözlemlenmemiştir. 48. saatte ise bu gruptaki nöronlar arasında istatiksel olarak anlamlı fark yoktur. Bir diğer grup olan evre 3 nöronlar aksonal dallanma için istatiksel olarak incelenmiştir. Bu grupta 24 saatteki nöron sayısının yetersizliğinden dolayı sadece transfeksiyondan 48 saat sonra fikse edilip boyanan hücreler analize dahil edilmiştir. Bu grupta, S268A aşırı eksprese edilmiş nöronlar kontrol ve S268D aşırı eksprese edilmiş nöronlara kıyasla aksonal dallanmayı istatiksel olarak önemli bir şekilde azaltırken, S268D aşırı eksprese edilmiş nöronlar kontrol grubuyla benzerlik göstermiştir. Diğer bir istatiksel analiz olarak, evre 2 ve evre 3 nöronlarda transfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra minor işlem sayıları sayılmış ve istatiksel analizler yapılmıştır. Evre 2 nöronlarda, S268A ve S268D aşırı eksprese eden nöronlar arasında istatiksel olarak anlamlı bir fark gözlemlenmezken, bu gruplarda kontrol grubuna kıyasla minor işlem sayısında artış gözlemlenmiştir. Erken evre 3 nöronlar için 24. saatte minor işlem sayısında gruplar arası herhangi bir anlamlılık gözlemlenmezken, 48. saatte yalnızca kontrol ve S268D spastini aşırı eksprese eden nöronlar arasında istatiksel olarak fark gözlemlenmiştir. Evre 3 nöronlar için 24 saatteki hücre sayısı yetersizliğinden dolayı sadece 48 saatteki evre 3 nöronlarda minor işlemler için istatiksel analizler gerçekleştirilmiştir. Bu sonuçlarda da, S268A ve S268D grupları arasında anlamlı bir fark gözlemlenmezken kontrol grubuna kıyasla spastinin mutantlarının aşırı eksprese edildiği nöronlarda minor işlem sayısının arttığı gözlemlenmiştir. Kontrol-S268D grubu arasındaki bu artış kontrol-S268A grubu arasındaki artıştan daha fazla olduğu görülmüştür. Ardından, spastinin fosforilasyona bağlı olarak nöronların evrelerindeki etki durumunun gözlemlenebilmesi için, spastin mutantlarının başarıyla transfeksiyonu gerçekleştirilmiş hücreler arasından evre 1, evre 2 ve evre 3 nöron sayıları belirlenmiştir. S268D spastini eksprese eden toplam hücre sayısı S268A'yı eksprese eden hücre sayısından daha fazladır. Her iki grup için de 24. saatteki ve 48. saatteki evre 2 ve evre 3 nöron sayıları yüzdesel olarak karşılaştırıldığında bu sayılar birbirine benzerdir. Evre 1 nöronlar için ise S268D spastini eksprese eden nöronlarda 24. saatten 48. saate geçerken evre 1 nöron sayısındaki azalış, S268A spastini eksprese eden nöronlara göre daha azdır. Nöronal morfolojideki fosforilasyona bağlı değişikliklerin gözlemlenmesini hedeflediğimiz bu çalışmada nörodejenerasyonda rol oynayan spastin proteinin post-translasyonel regülasyonu hakkında birtakım sonuçlar elde edilmiştir. Spastinin nöronal morfolojideki fosforilasyona bağlı gözlemlenen değişikliklikler göz önünde bulundurulduğunda, spastinin değişen fosforilasyon durumunun fonksiyonunda ve regülasyonunda görevli olan proteinlerden kaynaklı olabileceği düşünülmüştür. Buradan yola çıkarak, laboratuvarımızda yapılan bir çalışmada primer sıçan hipokampal nöronları kullanılarak S268 fosforilasyonuna bağlı olarak değişebilecek etkileşim partnerlerini tanımlamak için kütle spektrometri analizleri gerçekleştirilmiştir. Bu ön veriler göz önünde bulundurulduğunda iki aday protein, spastin ile etkileşimini tanımlamak için ele alınmıştır. Bu proteinlerden biri, daha önce laboratuvarımızda çalışılmış olan nöron spesifik protein olan septin3 iken, diğer bir aday protein ise proteozomal degradasyonda rol oynadığı bilinen SQSTM1/p62 proteinidir. Daha önceki bir çalışmada S268 fosforilasyonunun proteozomal degradasyonu önleyerek spastin stabilitesini arttırdığı göz önünde bulundurulduğunda p62 proteinin aday protein olarak belirlenmesi bu çalışma için önem taşımaktadır. Yapılan bu çalışmada,“septin3 & spastin”,“p62 & spastin”etkileşimleri ilk kez tanımlanmıştır. Fakat sonuçlar septin3 veya p62 proteinlerinin spastin ile etkileşiminin, spastinin S268 fosforilasyonuna bağlı olarak değişmediğini göstermiştir.

Özet (Çeviri)

Cytoskeleton is an essential structure within a cell that takes part in cell signaling, cell movement, cell division and internal molecule transportation. Components of the cytoskeleton consist of three different polymeric structures which are actin filaments, intermediate filaments, and microtubules. Actin filaments play roles in cell movement and conservation of cell shape while intermediate filaments take part in intercellular junctions and supporting cell structure. The third cytoskeletal element, microtubules (MT), take part in organelle transportation within cells, mitotic cell division and neuronal development. Ranging between several centimeters with a diameter of 25 nm, microtubules consist of α-tubulin ve β-tubulin protein subunits which create heterodimers by making covalent bonds with each other. Another subunit, γ-tubulin, ensures the proper assembly of α-tubulin and β-tubulin by serving as a template. Microtubules have a dynamic structure which enables them to grow and shrink or reorganize within a cell via microtubule severing enzymes. Spastin is an enzyme which belongs to ATPase Associated with diverse cellular Activities (AAA) family and takes a role in microtubule severing. Spastin activity and proper functioning are essential for neuronal morphogenesis. Spastin protein encoded by SPG4 gene consists of 616 amino acids. Previous studies suggest a relationship between mutations in SPG4 gene and Hereditary Spastic Paraplegia (HSP) which is a disease causing spasticity in lower extremities. Spastin, which plays a role in the degeneration of motor pathways in HSP, is especially involved in the regulation of synapse development, axonal arborization, axonal transport, neurite outgrowth. Regulation of these cellular processes is dynamic, so it is crucial to understand regulation of spastin protein at the post-translational level. Recent study has shown that HIPK2-mediated phosphorylation of spastin on serine 268 residue is required for increased stability of spastin by inhibiting its degradation. In this study, we aimed to investigate the effect of post-translational modifications of spastin on neuronal morphology in hippocampal neurons. Within the scope of this thesis, non-phosphorylated (S268A) and phosphomimetic (S268D) mutant forms of spastin were overexpressed in primary rat hippocampal neurons, and changes in neuronal morphology were investigated via immunocytochemistry (ICC) analysis. Firstly, the effect of S268 phosphorylation of spastin on length of axon was examined. There was no significant difference between the groups at 24 hours and 48 hours in all stage 3 neurons. Then, the number of axonal branches was counted and statistically analyzed in early stage 3 neurons (axonal length of 40-100 µm) and stage 3 neurons (axon length of +100 µm) in which spastin mutants were overexpressed. In early stage 3 neurons, there was a statistical difference only between the S268A and control groups at 24 hours. At 48 hours, there was no significant difference between the groups. In stage 3 neurons expressing the S268A form of spastin, the number of axonal branches was statistically significantly decreased compared to control neurons and neurons expressing S268D spastin. There was no statistically significant difference between S268D spastin and the control group. These results show that the change in the S268 phosphorylation of spastin has an effect on axonal branching in hippocampal neurons in axon length of +100 µm. Then, minor processes in stage 2 and stage 3 neurons were counted and statistically analyzed to understand whether the altered S268 phosphorylation of spastin would affect the number of minor processes. In stage 2 neurons expressing S268A or S268D, no difference was observed between S268A and S268D spastins at 24 and 48 hours, whereas both forms of spastin increased the number of minor processes compared to the control group. For early stage 3 neurons, there was no statistical significance between the groups at 24 hours, while the number of minor processes was increased in S268A or S268D expressing neurons at 48 hours compared to the control group. This statistical increase is higher in S268D spastin than in S268A spastin, but there is no significant difference between S268A and S268D expressing neurons. Statistical analysis could not be performed for stage 3 neurons due to insufficient cell numbers at 24 hours. For these neurons at 48 hours, the number of minor processes was increased in groups S268A spastin and S268D spastin compared to the control group. While there is no statistical significance between S268A and S268D, the statistical increase in S268D is higher than in S268A compared to the control group. In addition to these statistical analyzes, the number of stage 1, stage 2 and stage 3 neurons in S268A expressing neurons and S268D expressing neurons were determined. Although stage 2 and stage 3 neuron numbers were similar for S268A and S268D during the transition from 24 hours to 48 hours, the number of neurons remaining in stage 1 in the S268D group was higher than S268A during the transition from 24 hours to 48 hours. As a conclusion, these results suggest that phosphorylation status of S268 position affects axonal branching by regulating spastin function. Considering the observed changes in the neuronal morphology of spastin due to phosphorylation, it was thought that the altered phosphorylation status of spastin might be caused by proteins involved in the function and regulation. Based on this, mass spectrometry analyzes were performed using primary rat hippocampal neurons to identify interaction partners that may change depending on S268 phosphorylation. Given these preliminary data, two candidate proteins were considered for further analysis for their interaction with spastin depending on spastin's phosphorylation status. One of these proteins is septin3, the neuron-specific protein previously studied in our laboratory and known to play a role in neuronal morphology, while another candidate protein is SQSTM1/p62, which is known to play a role in proteosomal degradation. Considering that in a previous study, S268 phosphorylation increased spastin stability by preventing proteosomal degradation, analysis of p62 protein as a candidate protein is important for this study. In this study,“septin3 & spastin”, or“p62 & spastin”interactions were defined for the first time. However, the results showed that the interaction of septin3 or p62 proteins with spastin was not altered due to by S268 phosphorylation of spastin.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    692806

    Investigation of the effect of ATP13A2 (PARK9) frameshift mutation on the protein function

    ATP13A2 (PARK9) çerçeve kayması mutasyonunun protein fonksiyonuna etkisinin incelenmesi

    KORAY KIRIMTAY

    Doktora

    İngilizce

    İngilizce

    2021

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ARZU KARABAY KORKMAZ

  2. Tez No

    851078

    Coiled coil domain containing protein 124'ün post-translasyonel modifikasyonlarının hücresel moleküler etkileşimler üzerine etkileri

    The effects of post-translational modifications of coiled coil domain containing protein 124 on cellular molecular interactions

    GAMZE ÇAKIRCA

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    BiyolojiGebze Teknik Üniversitesi

    Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. UYGAR HALİS TAZEBAY

  3. Tez No

    686778

    Renal kanser hücre hattında (CAKI-2) karbonik Anhidraz-IX enzim inhibisyonunun mTOR proteini üzerine etkilerinin araştırılması

    Investigation of the effects of carbonic anhydrase-IX inhibition on mTOR protein in Renal Cancer Cell Line (CAKI-2)

    EMİNE TERZİ

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    BiyokimyaAnkara Yıldırım Beyazıt Üniversitesi

    Kanser Biyolojisi Bilim Dalı

    PROF. DR. ÖZEN ÖZENSOY GÜLER

  4. Tez No

    531251

    Meme kanserinde PKİ-402'nin PI3K/AKT/mtor yolağı ve radyo duyarlılık üzerindeki etkilerinin araştırılması

    Investigation of the effects of PKI-402 on pi3k/AKT/MTOR pathway and radio sensitivity in breast cancer

    ROYA GASIMLI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    OnkolojiEge Üniversitesi

    Temel Onkoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. CUMHUR GÜNDÜZ

  5. Tez No

    659861

    Özgün metil jasmonat mimetiklerinin hücre canlılığı üzerine etkinliklerinin insan akciğer ve yumurtalık kanser hatlarında incelenmesi

    Investigation of the effects of novel methyl jasmonate mimetics on cell vitality in human lung and ovarian cancer lines

    BÜŞRA EMİNE YAZICI

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2021

    Tıbbi Biyolojiİstanbul Medipol Üniversitesi

    Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. ESRA ÇAĞAVİ

    DOÇ. DR. MUSTAFA GÜZEL

Geri Dön