Nükleer manyetik rezonans ve kütle spektroskopisi ile biyotinidaz enzim aktivite ölçüm yönteminin geliştirilmesi
Development of biotinidaze enzyme activity measurement method by nuclear magnetic resonance and mass spectroscopy
- Tez No: 894937
- Danışmanlar: PROF. ŞAHABETTİN SELEK
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Bezm-i Alem Vakıf Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Biyokimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Tıbbi Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 128
Özet
Biyotinidaz (BTD) (EC 3.5.1.12), glikoprotein yapısında yaklaşık 80 kDa ağırlığında karaciğer ve beyin başta olmak üzere birçok dokuda bulunan bir enzimdir. Biyotinidaz enzimi diyetle alınan biyotinil peptitlerden ve biyositinden biyotin vitaminini kopararak serbest bırakır. Bu sayede karboksilaz enzimlerinin kofaktörü olan serbest biyotin sağlanmış olur. Otozomal resesif geçişli bir rahatsızlık olan biyotinidaz eksikliği serbest biyotin döngüsünün bozulmasıyla karakterizedir. Şayet biyotinidaz eksikliğine bağlı olarak metabolizmada serbest biyotin sağlanamaz ise biyotin bağımlı karboksilazlarda (asetil CoA karboksilaz, propiyonil CoA karboksilaz, pirüvat karboksilaz, β-metilkrotonil CoA karboksilaz) aktivite kaybı olur. Bunun sonucunda aminoasit katabolizması, glukoneojenez ve yağ asit sentezi gibi önemli metabolik yolaklarda homeostaz bozulur ve başta nörolojik bozukluklar olmak üzere gelişme gerilikleri, deri hastalıkları gibi birçok hastalık gelişir. Doğal substratı biyositin ve biyotinilpeptidler olan biyotinidaz biyotin ile farklı moleküller arasındaki amid bağlarını parçalayabilir. Biyotinidazın bu özelliğinden faydalanarak enzim aktivitesini ölçmek için Biyotinil-p-aminobenzoat (B-PABA) ve biyotinil-6-aminokinolin gibi yapay substratlar geliştirilerek spektrofotometrik ve florometrik yöntemler ile enzim aktivitesi tespit yöntemleri geliştirilmiştir. Türkiye dahil dünyanın birçok ülkesinde yenidoğan tarama programlarında biyotinidaz enzim eksikliği tanısı için spektrofotometrik ve florometrik yöntemler kullanılmaktadır. Fakat bu yöntemlerin dezavantajı yanlış sonuç verme oranlarının yüksek olmasıdır. Teknolojinin gelişmesi ile birlikte Nükleer manyetik rezonans (NMR), Sıvı kromatografisi tandem kütle spektrometresi (LC-MS/MS) gibi yüksek hassasiyetli ileri teknoloji analiz cihazlarının laboratuvarlarda kullanılma oranı artmıştır. Bu tez çalışmasında NMR ve LC-MS/MS cihazlarını kullanarak yüksek hassasiyetli, düşük hata oranına sahip, tekrarlanabilir biyotinidaz enzim aktivitesi ölçüm metodu geliştirilmiştir. Çalışma esnasında yerli üretim Biyotinil Aminoantipirin (BAA) ve en sık kullanılan ticari B-PABA molekülleri substrat olarak kullanılmıştır. Biyotinidaz enzim aktivitesi reaksiyon sonucu ortaya çıkan biyotin miktarının konsantrasyon artışının LC-MS/MS ve NMR cihazı ile tespitine dayanır. Bu bağlamda ilk olarak LC-MS/MS ile biyotine özel parmak izi niteliğinde olana ana ve fragman iyonlar belirlenmiştir. 5 dk lık bu metotta ana iyonun 245 m/z ve fragman iyonun ise 227 m/z biyotine karakterize pikler verdiği tespit edilmiştir. Optimizasyon çalışmaları neticesinde biyotinidaz enziminin 100 mM, pH 6 fosfat tamponu içerisinde, substrat varlığında 37 0C de en yüksek aktiviteyi verdiği belirlenmiştir. Oluşturulan yeni metotta BAA substratı ile istenilen seviyede aktivite alınamamıştır. Substrat olarak B-PABA nın kullanıldığı metotta önceden enzim aktivite değerlerini bildiğimiz numuneler ile korele sonuçlar elde edilmiştir. Metot validasyonu çalışması kapsamında iki farklı numunede 20 tekrarlı ölçüm çalışması sonucunda Y=0,7818 C+0,0662, ve korelasyon katsayısı R2=0.9877 sonucuna ulaşılmıştır. Bir ay süren stabilite çalışmaları neticesinde +4 0C de bekletilen numunelerde aktivite kaybının %15, ve- 20 0C de bekletilen numunelerde ise kaybın sadece %5 olduğu belirlendi. 25 numuneden 3 tekrar ile yapılan ölçüm ve raporlama değerleri çalışması sonucunda standart sapmanın 0.094, Kantitasyon sınırı (LOQ) 0.939 ve Tespit sınırı (LOD) 0.282 IU olduğu belirlenmiştir. Geliştirilen bu yeni LC-MS/MS yöntem ile halen uygulamada olan birçok biyotinidaz aktivitesi ölçüm metodundan daha hassas, daha kesin sonuçlar alınabilmiştir. Protein çöktürme işlemi gerçekleştikten sonra bu yöntem kullanılarak sadece 5 dk içinde hızlı ve güvenilir sonuç alınabilir. Talep edildiğinde, uygun saklama koşullarında muhafaza edilen örneklerin 30 gün sonra dahi tekrar hassas ölçümlerini elde etmek mümkündür.
Özet (Çeviri)
Biotinidase (EC 3.5.1.12) is an enzyme with a glycoprotein structure, weighing approximately 80 kD, and is found in many tissues, especially the liver and brain. The main function of the biotinidase enzyme is to cleave and release vitamin biotin from dietary biotinyl peptide sources. In this way, free biotin, which is the cofactor of carboxylase enzymes, is provided to the system. Biotinidase deficiency, an autosomal recessive disorder, is characterized by disruption of the free biotin cycle. If free biotin cannot be provided in metabolism due to biotinidase deficiency, there is a loss of activity in biotin-dependent carboxylases (acetyl CoA carboxylase, propionyl CoA carboxylase, pyruvate carboxylase, β-methylcrotonyl CoA carboxylase). As a result, homeostasis is disrupted in important metabolic pathways such as amino acid catabolism, gluconeogenesis and fatty acid synthesis, and many diseases such as neurological disorders, developmental delays and skin diseases develop. Biotinidase, whose natural substrate is biotinylpeptides, can cleave the amide bonds between biotin and different molecules attached to it. Artificial substrates such as B-PABA and biotinyl-6-aminoquinoline have been developed to measure enzyme activity by taking advantage of this feature of biotinidase. Enzyme activity measurement methods have been developed using the spectrophotometric and fluorometric properties of these substrates. Diagnosis of biotinidase enzyme deficiency is still made using these methods in the newborn screening programs of many countries of the world, including Turkey. Unfortunately, the rate of incorrect results with the mentioned methods is very high. With the development of technology, the use of high-precision advanced technology analysis devices such as NMR and LC-MS/MS in laboratories has increased. In this thesis study, a highly sensitive, low error rate, reproducible biotinidase enzyme activity measurement method was developed using NMR and LC-MS/MS devices. During the study, domestically produced Biotinyl Aminoantipyrine (BAA) and the most commonly used commercial B-PABA molecules were used as substrates. LC-MS/MS and NMR biotinidase activity measurement method is based on the determination of the amount of biotin increased as a result of the enzyme reaction. In this context, firstly, main and fragment ions, which are biotin-specific fingerprints, were determined by LC-MS/MS. In this 5-minute method, signals characterizing biotin were detected for the main ion at 245 m/z and the fragment ion at 227 m/z. As a result of optimization studies, it was determined that biotinidase enzyme reached its highest activity in the presence of substrate, at 37 0C and in 100 mM, pH 6 phosphate buffer. In the new method, the desired level of activity could not be obtained using the BAA substrate. It was determined that the method using B-PABA as the substrate was correlated with the results obtained from external laboratories. Within the scope of the method validation study, as a result of 20 repeated measurements on two different samples, Y=0.7818 C+0.0662 and correlation coefficient R2=0.9877 were obtained. As a result of stability studies lasting one month, it was determined that the loss of activity was 15% in samples kept at +4 0C, and the loss was only 5% in samples kept at -20 0C. Measurement and evaluation experiments performed with 3 repetitions from 25 samples showed standard deviation: 0.094, LOQ: 0.939 and LOD: 0.282 IU. With this new LC-MS/MS method, more sensitive and precise results can be obtained than many biotinidase activity measurement methods currently in practice. After the protein precipitation process is completed, results can be obtained in just 5 minutes using this method. If desired, precise measurements can be obtained again even after a month from samples stored under appropriate storage conditions.
Benzer Tezler
- Topaklanmaya bağlı ışıma uygulanarak 3-(4-metoksifenil) tiyofen ve bor içeren organik ışık yayan moleküllerin sentezi ve özelliklerinin incelenmesi
Implementing aggregation induced emission to synthesis and investigation of the properties of organic light emitting materials which include 3-(4-methoxyphenyl)thiophene and boron
ERDEM ENGÜR
Yüksek Lisans
Türkçe
2017
KimyaYıldız Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEHRA NÜKET ÖCAL SUNGUROĞLU
- Ditiyenotiyofen türevlerinin topaklanmaya bağlı ışıma özelliklerinin arttırılması için hacimli gruplarla fonksiyonlandırılması ve özelliklerinin incelenmesi
Investigation of the properties of functionalized dithienothiophene derivatives with bulky groups for enhancement of aggregation induced emission
FATMA GÖZDE AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
KimyaYıldız Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEHRA NÜKET ÖCAL SUNGUROĞLU
PROF. DR. TURAN ÖZTÜRK
- Sanicula europaea L. bitkisinden antiviral bir maddenin saflaştırılması ve kimyasal karakterizasyonu
Purification and chemical characterization of an antiviral substance from the plant Sanicula europaea L.
NAZLI ARDA
- İndol yapı iskelesinden potansiyel biyolojik aktif bileşiklerin sentezi
Synthesis of potential biological active compounds via the indole scaffold
SEHER AYDIN
- Kuvvetli donör ve akseptör grupları içeren yeni azo boyarmaddelerin sentezi, fotofiziksel özelliklerinin ve anyon-katyon duyarlılıklarının incelenmesi
The synthesis of new azo dyes containing strong donoracceptor groups and investigation of photophysical properties and anion-kation sensitivity
ÖMER ARSLAN