Bacillus mojavensis TH309 tipII I-asparajinaz geninin klonlaması ve heterolog ifadesi
Cloning and heterolog expression of the bacillus mojavensis TH309 type II I-asparaginase gene
- Tez No: 900342
- Danışmanlar: DOÇ. DR. ALİ OSMAN ADIGÜZEL
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ondokuz Mayıs Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 73
Özet
Asparajinin amonyak ve aspartata parçalanmasını katalize eden Tip II Lasparaginaz enzimleri, tıpta lenfoblastik lösemi (ALL) ve diğer bazı hematolojik malignitelerin tedavisinin yanı sıra gıda endüstrisinde akrilamid oluşum riskinin azaltılması amacıyla kullanılabilmektedir. Sunulan bu tez çalışmasında; Bacillus mojavensis TH309 genomundaki tip II L-asparaginaz enzimini kodlayan genin Escherichia coli BL21(DE3)'de ifadesi gerçekleştirilmiştir. İlk olarak; yaklaşık 1083 bç büyüklüğündeki B. mojavensis TH309 tip II L-asparaginaz geni (aspII) polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve pET20b(+) vektörüne klonlanmıştır. Rekombinant molekül ısı şoku uygulanarak E. coli BL21(DE3)'ye transforme edilmiştir. Rekombinant molekülü içeren klonun (E. coli BL21(DE3)-pET20b(+)- aspII) 100 mM IPTG varlığında kültüvasyonu ile aspII'nin ifadesi (BmAspII) gerçekleştirilmiştir. Üretilen enzim miktarı ve spesifik aktivitesi sırasıyla 7.65 U/mg protein ve 253.4 U/mL olarak tespit edilmiştir. SDS-PAGE analizi sonucunda heterolog olarak ifade edilen BmAspII enziminin moleküler ağırlığının yaklaşık 35 kDa olduğu tespit edilmiştir. Enzim; nikel-afinite kromotografisi yöntemi ile %76.5 verimle 5.3 kat saflaştırılmıştır. Enzimin en iyi aktivite sergilediği sıcaklık ve pH sırasıyla 37 °C ve 8.0 olarak tespit edilmiştir. Mg²⁺ ve Ca²⁺ enzim aktivitesini sırasıyla %46.2 ve %38.4 arttırdığı, Zn²⁺ ve Cu²⁺ ise sırasıyla %29.7 ve %22.3 azalttığı tespit edilmiştir. Test edilen kimyasallardan PMSF ve EDTA'nın enzim aktivitesi üzerinde aktive edici, SDS ve β-mercaptoethanol'un ise inhibe edici etkisi olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, enzimin amino asitlerinin %23'ü alfa helks, %23'ünün de beta-tabakada konumlandığı tespit edilmiştir. Ayrıca; enzimin pKI, aliphatic indeksi ve GRAVY değerleri sırasıyla 8.79, 89.79 ve -0.228 olarak hesaplanmıştır
Özet (Çeviri)
Type II L-asparaginase enzymes, which catalyze the breakdown of asparagine into ammonia and aspartate, are used in medicine for the treatment of lymphoblastic leukemia (ALL) and other hematological malignancies, as well as in the food industry to reduce the risk of acrylamide formation. In this thesis study, the gene encoding the type II L-asparaginase enzyme from the genome of Bacillus mojavensis TH309 was expressed in Escherichia coli BL21(DE3). First, the approximately 1083 bp B. mojavensis TH309 type II L-asparaginase gene (aspII) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) and cloned into the pET20b(+) vector. The recombinant molecule was transformed into E. coli BL21(DE3) by heat shock. The expression of aspII (BmAspII) was induced in the clone containing the recombinant molecule (E. coli BL21(DE3)-pET20b(+)-aspII) in the presence of 0.5 mM IPTG. The amount of enzyme produced and its specific activity were determined to be 7.65 U/mg protein and 253.4 U/mL, respectively. SDS-PAGE analysis revealed that the molecular weight of the heterologously expressed BmAspII enzyme was approximately 35 kDa. The enzyme was purified using nickel-affinity chromatography with a yield of 76.5% and a purification fold of 5.3. The optimal temperature and pH for the enzyme's activity were found to be 37°C and 8.0, respectively. Mg²⁺ and Ca²⁺ increased enzyme activity by 46.2% and 38.4%, respectively, while Zn²⁺ and Cu²⁺ decreased it by 29.7% and 22.3%, respectively. Of the chemicals tested, PMSF and EDTA were found to enhance enzyme activity, while SDS and β-mercaptoethanol had inhibitory effects. In addition, it was found that 23% of the enzyme's amino acids were located in alpha helices and another 23% in beta sheets. Furthermore, the enzyme's isoelectric point, aliphatic index, and GRAVY values were calculated to be 8.79, 89.79, and -0.228, respectively.
Benzer Tezler
- Bacillus mojavensis TH309 suşundaki pektat liyaz (BmoPelC) enziminin klonlanması ve ifadesi üzerine çalışmalar
Studies on cloning and expression of the pectate lyase (BmoPelC) enzyme from Bacillus mojavensis TH309
NURAYAN AYDIN
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DR. ÖĞR. ÜYESİ TUĞRUL DORUK
- Bacillus mojavensis TH309 türüne ait pektat liyazın (BmoPelA) saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of pectate lyase (BmoPelA) from Bacillus mojavensis TH309
SÜMEYYE CİLMELİ
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
BiyoteknolojiOndokuz Mayıs ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜNİR TUNÇER
- Bacillus mojavensis ve Bacillus vallismortis'ten alfa-amilaz üretimi, saflaştırılması ve karakterizasyonu
Alpha amylase production, purification and characterization of Bacillus mojavensis and Bacillus vallismortis
ADEM KARAKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyolojiSiirt ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SADİN ÖZDEMİR
YRD. DOÇ. DR. ERDAL ÖĞÜN
- Bacillus vallismortis ve Bacillus mojavensis'in U(VI) dirençliliği, biyoakümulasyonu ve çevre biyoteknolojisinde kullanımı üzerine çalışmalar
Works on U(VI) resistance, biochemistry and environmental biotechnology bacillus vallismortis and bacillus mojavensis
MEHMET KADİR ODUNCU
Yüksek Lisans
Türkçe
2016
BiyolojiSiirt ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. SADİN ÖZDEMİR
YRD. DOÇ. DR. ERDAL ÖĞÜN
- Kitinolitik Bacillus suşları kullanılarak kitooligosakkaritlerin enzimatik üretimi
Enzymatic synthesis of chitooligosaccharides by using chitinolytic Bacillus strains
FAKHRA LIAQAT