Geri Dön

Investigation of cobalt resistance in Rhodobacter sphaeroides at molecular level

Rhodobacter sphaeroides'de kobalt direncinin moleküler düzeyde incelenmesi

PDF İndir

  1. Tez No: 907068
  2. Yazar: GÜNEŞ ATAY
  3. Danışmanlar: PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Biotechnology, Genetics
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: İngilizce
  9. Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
  10. Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 93

Özet

Gram-negatif α-proteobakteri olan Rhodobacter sphaeroides, mor kükürtsüz bakterilerdendir. Değişen çevresel koşullara ve ortamdaki substratların varlığına göre metabolizmasını mevcut koşullara adapte edebilme yeteneğine sahiptir. Farklı proses koşulları altında yüksek düzeyde metabolik çeşitlilik göstererek; oksijenli solunum, oksijensiz solunum, fotosentez veya fermantasyon yapabilir. Bu özelliği fotoototrofik, kemoototrofik, ototrofik ve heterotrofik uygulamalarda kullanılmasını sağlar. R. sphaeroides çamurlu alanlarda, toprakta, göllerde veya durgun sularda bulunabilir. Sahip olduğu flagellum sayesinde hareket yeteneğine sahiptir, sıvı ortamda ortalama 45 ile 80 μm/s hızda yüzer. Hareketi ortamdaki hidrojen iyonu değişime bağlıdır ve kısa duraklamalar yapıp hareketini kesintiye uğratarak tek yönlü olarak dönüş yapabilir. Pek çok sektörde yoğun bir şekilde kullanılan plastikler genel olarak petrolden türevlenir. Üretilen bu sentetik polimerler doğada uzun yıllar kalıntı bırakarak toksik madde birikimine neden olduğundan, sentetik polimerlere alternatif olarak günümüzde çevre dostu, biyolojik olarak parçalanabilen, yenilenebilir biyoplastiklerin üretimi ve kullanımı önem kazanmıştır. R. sphaeroides, biyolojik olarak parçalanabilen bir poliester olan polihidroksibütiratı (PHB) hücre içi granüller halinde yüksek miktarda sentezleyebilme ve depolama yeteneğine sahiptir. Patojenik olmayan R. sphaeroides, yüksek katma değerli ürünlerin güvenli bir şekilde üretimi için sürdürülebilir bir seçenektir. R. sphaeroides tarafından sentezlenerek çeşitli sektörlerde kullanılabilen diğer ürünlere başka bir örnek de medikal alanda kalp hastalıklarının tedavisinde, kozmetikte ve gıda endüstrisinde yiyecek katkı maddesi olarak kullanılabilen Koenzim Q10'dir. 5-aminolevulinik asit (ALA) tarımda bitki gelişme düzenleyicisi, yabani ot öldürücü veya fitohormon olarak, sağlık alanında ise kanser hücrelerinin takibi amacıyla farklı biyoteknolojik uygulamalarda kullanılabilir. R. sphaeroides bulunduğu ortamın bileşimi ve koşulları optimize edilerek, yüksek verimde 5-ALA sentezleyebilir. R. sphaeroides, organik substratları kullanarak sürdürülebilir bir enerji kaynağı olan biyohidrojeni üretebilir. Farklı substratları kullanabilme yeteneği ve verimli bir şekilde substrat dönüşümü yapabilmesi sayesinde hidrojenin biyolojik olarak üretimi için sıklıkla tercih edilmektedir. Tüm bunlara ek olarak, R. sphaeroides'in doğal ortamda yaygın olarak bulunması, hızlı üreme döngüsü ve basit ortam şartlarında gelişebilmesi sahip olduğu diğer avantajlardandır. Karotenoidler kırmızı, sarı, turuncu ve mor gibi farklı renklerde bulunabilen ve yağda çözünen pigmentlerdir. Aynı zamanda antioksidan özelliğe sahip olup, bakteriler, algler, bitkiler dahil fotosentetik organizmalardaki komplekslerin aktif bileşenleridir. Karotenoidler kansere ve kalp hastalıklarına karşı koruma sağlayabilmeleri nedeniyle önemlidir. Ayrıca renklendirici, A vitamini öncüsü, antikor üretimini arttırıcı ve fonksiyonel takviye olarak da kullanılmaktadırlar. Günümüzde karotenoidlerin üretimi çoğunlukla sentetik olarak kimyasal yöntemlerle gerçekleştirilmektedir. Ancak kimyasal sentez yöntemlerinin yüksek maliyet ve toksisite gibi birçok dezavantajı vardır. R. sphaeroides gibi karotenoid üreten mikroorganizmalar tarafından yapılan alternatif biyosentez, nispeten yüksek karotenoid verimi, ihmal edilebilir düzeyde toksisite ve düşük maliyet avantajlarına sahip olması nedeniyle tercih edilmektedir. Kobalt, çeşitli endüstriyel sektörlerde yaygın olarak kullanılan manyetik özelliklere sahip bir elementtir. Kobalt, alaşım rafine etme, elektrolizle metal kaplama, petrol ve kimya endüstrilerinde katalizör görevi görmesinin yanı sıra türbin kanatları, jet motorları, elektrokimyasal malzemeler ve mıknatısların imalatında da kullanım alanı bulmaktadır. Ayrıca katalizörlerde, boyalarda, verniklerde, pigmentlerde, mürekkeplerde, seramiklerde ve cerrahi implantlarda da kullanılır. Tıbbi uygulamalarda mikrobiyal enfeksiyonun tedavisinde nanopartikül olarak kullanılabileceği gibi, protez uygulamalarında ve radyoterapide de kullanılabilir. Kobalt, endüstrideki öneminin yanı sıra biyolojik sistemlerde de önemli rollere sahiptir. B12 vitamini (kobalamin) için kofaktör görevi gören ve mikroorganizmalar, bitkiler ve hayvanlardaki önemli enzimlerin katalitik süreçlerine katılan hayati bir mikro besin olarak görev yapar. Bununla birlikte, geçiş metali olması nedeniyle kobalt, yüksek konsantrasyonlarda mevcut olduğunda canlı organizmalar için toksisite sergileyebilir. R. sphaeroides'in yüksek kobalt toleransı, metal direnç mekanizmalarının daha fazla araştırılmasına yol açmıştır. Biyoremediasyon topraktan, sudan ve diğer ortamlardan kirleticilerin ve toksinlerin uzaklaştırılmasında; algler ve bakteriler gibi mikroorganizmaların kullanımını içeren bir biyoteknolojik uygulama alanıdır. Ağır metal içeren ortamlar da dahil olmak üzere toksik ve kirlenmiş ortamlara adapte olup, biyolojik iyileştirme yapabilme yeteneği, R. sphaeroides'in biyoteknolojik uygulamalar ve özellikle de biyoremediasyon için tercih edilebilirliğini daha da arttırmıştır. Çeşitli çalışmalar R. sphaeroides'in metal stresini tolere edebildiğini ve metal iyonlarını ayrıştırabildiğini göstermiştir. Literatürdeki çalışmalar Hg2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Co2+, MoO4 2- , CrO4 2- 'e özellikle de Co2+, MoO4 2- ve Fe2+ 'ye karşı R. sphaeroides'in oldukça dirençli olduğunu göstermiştir. Sahip olduğu çok yönlü metabolizma; dizilenmiş genomu ve ekstrem ihtiyaçları olmadan normal koşullarda iyi gelişebilme özelliği ile birleştiğinde, çeşitli biyoteknolojik uygulamalar için R. sphaeroides'in sıklıkla model organizma olarak kullanıldığı görülmüştür. Biyoteknolojik uygulamaların yanı sıra, ışık enerjisini elektrik enerjisine dönüştüren membran protein komplekslerinin geliştirilmesi ve yeni protein ekspresyon sistemlerinin araştırılması için de bu mikroorganizma tercih edilmektedir. Evrimsel mühendislik veya adaptif laboratuvar evrimi, moleküler temeli bilinmeyen, ancak endüstriyel açıdan önemli mikrobiyal özellikleri geliştirmek için kullanılan bir stratejidir. İstenilen fenotipi elde etmek için rastgele mutasyona ve sistematik seçilime dayalı evrim ilkelerinden yararlanır. Belirli bir stres türüne direnç kazanılması gibi arzu edilen, ancak genetik açıdan karmaşık özelliklerin moleküler temeli; yüksek dirençli evrimleşmiş suşun ve referans suşların karşılaştırmalı genomik, transkriptomik ve/veya fizyolojik analizi yapılarak aydınlatılabilir. Önceki çalışmada R. sphaeroides referans suşu, kültür ortamında kademeli olarak artacak şekilde 0,1-15 mM CoCl2 konsantrasyon aralığında evrimsel mühendislik ile seçilim prosedürüne tabi tutulmuştur. Son (64.) mutant popülasyon, seçilim öncesinde başlangıç popülasyonunda herhangi bir mutajen kullanılmadan, kobalt klorür stres seviyelerinin aşamalı olarak arttığı şartlarda elde edilmiştir. Son mutant popülasyonun R. sphaeroides için daha önce rapor edilmemiş olan 15 mM CoCl2 seviyesine kadar dayanıklı olduğu belirlenmiştir. Son popülasyondan rastgele seçilen yedi adet mutant birey incelenmiş ve mutant bireyler fizyolojik olarak karakterize edilmiştir. Karakterizasyon sonrasında, en dirençli mutant birey (G7), çeşitli stres faktörlerine karşı çapraz direnç göstermiş ve üstün direnç özelliklerine sahip olduğu için daha detaylı analiz için seçilmiştir. Bu çalışmada ise, G7'nin kobalt direnci mekanizmasının moleküler düzeyde incelenmesi amaçlanmıştır. Buna yönelik olarak, öncelikle Alevli Atomik Absorpsiyon Spektrometresi (AAS) yöntemi kullanılarak G7 mutant bireyinin hücre içinde CoCl2 tutup tutmadığı belirlenmiştir. AAS analizlerinin sonucunda, kobalt stres koşullarında hayatta kalabilen G7'nin kobaltı hücre içine aldığı/yüzeyinde tuttuğu tespit edilmiştir. Bu çalışmada ayrıca, G7 mutant bireyin ve referans suşun karşılaştırmalı tüm genom yeniden dizilemesi, kobalt tolerans mekanizması hakkında daha fazla bilgi edinmek ve bakterinin kobalt klorüre karşı direncine katkıda bulunabilecek spesifik tek nükleotid polimorfizmlerini belirlemek amacıyla gerçekleştirilmiştir. Tüm genom yeniden dizileme sonuçlarına göre, kobalt stresine dirençli G7 mutant bireyin genlerinde referans suşta bulunmayan 11 yanlış anlamlı (missense) mutasyon bulunmuştur. Bilinen mutasyona uğramış genler arasında mviN, hutC, rpoD, nifB ve nhaD genlerine rastlanmıştır. SNP'ler; transkripsiyonel regülasyonla, NifB ailesi FeMo kofaktör biyosenteziyle ilişkili genlerde; çeşitli virulans faktörleri, TRAP-T ailesi taşıyıcı proteinlerde, sodyum/proton taşıyıcılarda, farklı işlevleri olan genlerde ve R. sphaeroides'in kobalt direncinde rol oynayabilecek bilinmeyen fonksiyonları olan genlerde tespit edilmiştir. Yapılan çapraz direnç testleri, büyüme fizyolojisi sonuçları ve dizilenmiş genom verileri, farklı genlerdeki varyasyonları belirleyerek G7 suşunun kobalt ağır metal direncinin genetik altyapısı hakkında bilgi sağlamıştır. Kobalt klorür stres direncinde bu genlerin ve tespit edilen mutasyonların rolünü netleştirmek için, daha kapsamlı genomik ve proteomik çalışmalara yer verilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır.

Özet (Çeviri)

Rhodobacter sphaeroides, a Gram-negative α-proteobacterium, is able to perform photosynthesis and possesses a diverse array of metabolic capabilities. These capabilities include lithotrophy, respiration in both oxygen-rich and oxygen-poor environments, nitrogen-fixation, as well as the production of tetrapyrroles, chlorophylls, vitamin B12 and heme. R. sphaeroides possesses the ability to modify its metabolism, its metabolism can adapt to changes in environmental conditions and nutrient availability. This metabolic flexibility, combined with its fully sequenced genome and its ability to thrive under normal growth conditions, makes it a desirable choice for various biotechnological applications. It serves as a valuable model organism for the development and investigation of different protein expression systems. Particularly, it excels in the study of membrane protein complexes that convert light energy into electrical energy. This bacterium offers various advantages, including a fully sequenced genome, having an adaptive and well-known metabolism, and an enhanced membrane surface area when cultivated in oxygen-depleted environments. In a previous study, using evolutionary engineering, a R. sphaeroides mutant population resistant to cobalt chloride stress was obtained. This was achieved by subjecting the initial population to batch selection under gradually increased cobalt chloride stress conditions, without applying random mutagenesis prior to the selection process. Remarkably, the final mutant population exhibited resistance to cobalt levels as high as 15 mM, which has not been previously observed in R. sphaeroides. Seven mutant individuals selected from the final population were investigated, and mutant individuals were physiologically characterized. After characterization, the most resistant individual mutant (G7) with superior resistance properties was selected for more detailed analysis. Additional analysis of the G7 individual mutant from the final population revealed its ability to exhibit cross-resistance against various compounds like nickel (ІІ) chloride (2.2 mM, 2.4 mM), ethanol (8% v/v), sodium chloride (0.5 M), and aluminum chloride (5 mM), magnesium chloride (750 mM, 1M), iron (ІІ) chloride (5 mM), boric acid (30 mM, 50 mM), caffeine (20 mM) and ammonium iron (II) sulfate (5 mM). However, the underlying genomic causes of this physiological resistance capability remained unknown. The main aim of this study was to detect and analyze specific variations in the genetic makeup of the cobalt-resistant R. sphaeroides strain, known as single nucleotide polymorphisms (SNPs), which have the potential to significantly influence their resistance to cobalt chloride stress. By comprehensively exploring the interplay between these SNPs and their potential role in cobalt chloride stress resistance, this study aimed to shed light on the underlying mechanisms and pathways involved, ultimately contributing to a deeper understanding of bacterial adaptation and the development of effective strategies to combat cobalt chloride stress resistance. In this study, Flame Atomic Absorption Spectrometry (FAAS) method was used as a first step to gain insight into the cobalt resistance mechanism of G7 to determine if the mutant individual G7 retains cobalt ions inside the cell or not. As a result of the FAAS analyses, it was found that G7, which can survive in the presence of cobalt stress conditions, takes cobalt ions into/onto the cell. Moreover, to gain a detailed understanding of the underlying mechanisms behind cobalt tolerance, comparative Whole Genome Re-sequencing analysis was performed with G7 to identify and determine single nucleotide polymorphisms (SNPs) in this strain. Specifically, the G7 mutant individual and the Reference Strain (RS) were sequenced which allowed the identification of specific SNPs that potentially play a crucial role in the ability of G7 to resist cobalt chloride. By delving into the genetic variations and their potential implications, this approach aims to unravel the intricate mechanisms that contribute to cobalt resistance, thus paving the way for targeted interventions and strategies to combat this stress. According to whole genome re sequencing results, 11 missense mutations were found in various genes of the G7 mutant individual which were not present in the RS. Known mutated genes include mviN, hutC, rpoD, nifB and nhaD. Further genomic and proteomic studies would be necessary to understand the role of these genes and mutations in the cobalt chloride stress resistance of R. sphaeroides. To summarize, the comprehensive evaluation of cross-resistance tests, growth physiology observations, and genome sequencing data yielded significant insights into the genetic basis of cobalt stress resistance observed in the G7 strain. Through the identification of variations in different genes, this investigation has provided valuable information regarding the underlying mechanisms that contribute to the G7 strain's ability to withstand cobalt and other heavy metal stresses. These findings contribute to the understanding of the genetic background of heavy metal resistance and offer potential avenues for further research and targeted interventions in this field that involve R. sphaeroides.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    352302

    Physiological investigation of Rhodobacter sphaeroides

    Rhodobacter sphaeroides in fizyolojik incelenmesi

    ÖZGE ÖZMERAL

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2013

    Biyoteknolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    İleri Teknolojiler Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ZEYNEP PETEK ÇAKAR

  2. Tez No

    893664

    Kobalt esaslı Haynes 25 süper alaşımının aşınma ve korozyon davranışına bor kaplamanın etkisinin incelenmesi

    Investigation of the effect of boron coating on the wear and corrosion behavior of cobalt-based Haynes 25 superalloy

    ALİ GÜNDOĞAR

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Metalurji MühendisliğiKarabük Üniversitesi

    Metalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MELİK ÇETİN

  3. Tez No

    232127

    Düşük ve orta karbonlu çeliklerin yüzeyine TIG kaynak metoduyla kaplanan ostenitik paslanmaz çelik tozunun aşınma direncine karbür içeriğinin etkisinin araştırılması

    Investigation into the effect of carbide content on wear resistance of austenitic stainless steel powder coated low and medium carbon steels by TIG method

    MUSTAFA SABRİ GÖK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2008

    Metalurji MühendisliğiFırat Üniversitesi

    Metalurji Eğitimi Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. MEHMET H. KORKUT

  4. Tez No

    844856

    Kobalt esaslı Haynes 188 süper alaşımın kaynak kabiliyetinin araştırılması

    Investigation of the weldability of cobalt based Haynes 188 super alloys

    SAMET NOHUTÇU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Makine MühendisliğiKarabük Üniversitesi

    İmalat Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. RAMAZAN KAÇAR

  5. Tez No

    553698

    Stellite 6 ve Stellite 12 alaşımlarının darbeli kayma aşınma performanslarının incelenmesi

    Investigation of impact sliding wear performance ofstellite 6 and stellite 12 alloys

    ORÇUN ASLAN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Makine Mühendisliğiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Malzeme Bilimi ve Mühendisliği Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ CEVAT FAHİR ARISOY

Geri Dön