Geri Dön

Köpeklerde canine distemper virus enfeksiyonunun araştırılması virusa karşı monoklonal antikor üretimi ve antijen ELISA geliştirilmesi

Investigation of canine distemper virus infection in dogs production of monoclonal antibody against virus and development of antigen ELISA

PDF İndir

  1. Tez No: 908590
  2. Yazar: SERKAN KÖKKAYA
  3. Danışmanlar: DOÇ. DR. AYŞE GENÇAY GÖKSU
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Veteriner Hekimliği, Veterinary Medicine
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Erciyes Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Mikrobiyoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Viroloji Bilim Dalı
  13. Sayfa Sayısı: 137

Özet

Köpek gençlik hastalığı Canidae ailesi (köpek, çakal, kurt) olmak üzere Ursidae (dev panda), Ailuirdae (kırmızı panda), Mustelidae (ferret, mink), Felidae (aslan, leopar) gibi birçok aileyi etkileyen tüm dünyada oldukça yaygın viral bir hastalıktır. Yavru köpekler baĢta olmak üzere tüm yaĢ gruplarında görülebilmektedir. Solunum baĢta olmak üzer karıĢık bir klinik belirti gösterir. Hastalık etkeni Canine distempervirus (CDV) olup Paramyxoviridae ailesinden Morbillivirus genusu içerisindedir. Bu çalıĢmada CDV Ģüpheli köpeklerden örnekler alınarak virusun varlığının araĢtırılması, hücre kültüründe virusun izolasyonu, virusa karĢı monoklonal-poliklonal antikor üreterek antijen-ELISA geliĢtirilmesi amaçlanılmıĢtır. Bu amaç doğrultusunda Erciyes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Eğitim ve AraĢtırma ve Uygulama Hastanesi'ne getirilen CDV Ģüpheli 40 farklı köpekten kan ve swab örneği alınmıĢtır. RT-PCR ile doğrulanan örnekler MDCK hücre kültüründe ekim yapılarak virus izole edilmiĢtir. Daha sonra BALB/c diĢi fareler inaktif viruslar ile immunize edilerek hibridoma teknolojisi ile monoklonal antikorlar üretilmiĢtir. Aynı zamanda Yeni Zelanda ırkı tavĢanlar yine inaktif virus ile immunize edilerek poliklonal antikorlar üretilmiĢtir. Üretilen monoklonal antikor HRP enzimi ile iĢaretlenerek geliĢtiren ELISA testinde konjugat olarak kullanılmıĢtır. Bu tez çalıĢmasında köpek gençlik hastalığı Ģüpheli köpeklerden örnekler toplanılarak RT-PCR yöntemi ile doğrulama yapılmıĢtır. 40 farklı köpekten örnek toplanılarak 29 (%72.5) adedi pozitif olarak doğrulanmıĢtır. Örneklerin klinik bulgusuna göre genel tablosuna bakıldığında; hayvanların 25'i (%62.5) solunum yolu belirtili, 6'sı (%15) sinirsel belirtili, 9'u (%22.5) ise karıĢık (solunum+sinirsel) belirtili olarak bulunmuĢtur. RT-PCR sonucuna göre ise; solunum problemi olan 20 (%68.96), sinirsel problemi olan 3 (%10.34), karıĢık klinik tablo gösteren 6 (%20.68) olarak elde edilmiĢtir. Yine RT-PCR ile, yüksek ateĢ belirtileri (>38.5℃) gösteren 7 köpeğin 6'sı pozitif çıkarken, ateĢi normal olan 33 köpeğin 23'ü pozitif olarak değerlendirilmiĢtir. Örneklerin alındığı 40 köpeğin yaĢı 15'i (%37.5) 0-6 aylık, 11'i (%27.5), 8'i (%20) 12-24 aylık ve 6'sı (%15) >24 ay olarak kaydedilmiĢtir. RT-PCR testine göre bu yaĢ aralıklarında pozitif köpek sayısı sırasıyla; 14 (%48.27), 7 (%24.13), 5 (%17.24) ve 3 (%10.34) olarak bulunmuĢtur. Pozitif örnekler MDCK hücresine adsorpsiyonlu yöntemle ekim yapılarak CPE (sitopatik etki, cytopathic effect) yönünden günlük olarak ters mikroskop altında incelenilmiĢ ve 8. günden itibaren yuvarlaklaĢma ve vakuol Ģeklinde CPE'ler görülmüĢtür. RT-PCR ile doğrulanan örnek tekrarlı ekimlerle MDCK34388 izolatı olarak çoğaltılmıĢtır ve monoklonal-poliklonal antikor üretimi için kullanılmıĢtır. Fare izolasyonu sonrası füzyona girilmiĢ ve alt dilüsyon ve pasajlamalar sonucunda 1G10- vi 1A monoklonal antikoru elde edilerek Protein A ile saflaĢtırılmıĢtır ve Western blot yöntemi ile CDV F proteinine karĢı monoklonal antikor olduğu tespit edilmiĢtir. Daha sonra HRP enzimi ile iĢaretlenerek geliĢtirilen Antijen ELISA testinde konjugat olarak kullanılmıĢtır. Antijen ELISA testi sandviç ELISA test yöntemi Ģeklinde tasarlanarak poliklonal ve monoklonal antikorların ayrı ayrı optimizasyonları yapılmıĢtır. Antijen ELISA optimizasyon sonucunda 1/200 ve 1/400 oranında konjugat; 1/1000, 1/2000 ve 1/3000 oranlarında poliklonal antikor pozitiflik görülmüĢtür. Sahadan toplanan örnekler ve farklı zamanlarda izole edilen 11 farklı izolat pozitif olarak, ayrıca 40 farklı örnekte negatif olarak geliĢtirilen antijen ELISA testi ile araĢtırılmıĢ ve geliĢtirilen ELISA testinin spesifite ve sensitivitesi hesaplanılmıĢtır. Bu sonuca göre; 36 gerçek pozitif, 5 yanlıĢ negatif, 4 yanlıĢ pozitif, 35 gerçek negatif tespit edilmiĢtir ve sensitivitesi %90, spesifitesi %87.5 belirlenilmiĢtir. Ayrıca yapılan istatistiksel analiz sonucu pozitif tahmin değeri %87.8, negatif tahmin değeri ise %89.74 olarak belirlenilmiĢtir. Fisher's Exact test yöntemine göre ise p değeri anlamlı (p

Özet (Çeviri)

Canine Distemper is a widespread viral disease affecting various animal families, including Canidae (dogs, jackals, wolves), Ursidae (giant pandas), Ailuridae (red pandas), Mustelidae (ferrets, minks), and Felidae (lions, leopards). While it can affect animals of all ages, puppies are particularly susceptible. The disease primarily manifests with respiratory symptoms, though it can present a mix of clinical signs. The disease agent is Canine distempervirus (CDV) and is in the Morbillivirus genus of the Paramyxoviridae family. This study aimed to investigate the presence of CDV in suspected dogs, isolate the virus in cell culture, and develop an antigen-ELISA using monoclonal and polyclonal antibodies. Blood and swab samples were collected from 40 dogs with suspected CDV at Erciyes University's Veterinary Medicine Faculty Hospital. RT-PCR-confirmed samples were cultured in MDCK cells for virus isolation. BALB/c female mice and New Zealand rabbits were immunized with inactivated viruses to produce monoclonal and polyclonal antibodies, respectively. The monoclonal antibody was labelled with HRP enzyme for use in the ELISA test. Of the 40 sampled dogs, 29 (72.5%) tested positive for CDV. Clinical findings showed 62.5% with respiratory symptoms, 15% with nervous symptoms, and 22.5% with mixed symptoms. RT-PCR results revealed that 68.96% had respiratory issues, 10.34% had neurological problems, and 20.68% presented mixed clinical pictures. Most positive cases were found in dogs aged 0-6 months (48.27%). Positive samples were cultured on MDCK cells with the adsorption method and examined daily under an inverted microscope for CPE. CPEs in the form of rounding and vacuoles were observed starting from the 8th day. The MDCK34388 isolate was used for monoclonal-polyclonal antibody production. The 1G10-1A monoclonal antibody was developed and confirmed with Western blot to target the CDV F protein. An antigen ELISA test was optimized using both monoclonal and polyclonal antibodies. Samples collected from the field and 11 isolates isolated at different times were screened as positive, and 40 different samples as negative with the antigen ELISA test developed. According to this result, 36 true positives, four false negatives, five false positives, and 35 true negatives were detected. The sensitivity of the developed antigen ELISA test was determined as 90% and the specificity as 87.5%. In addition, the positive predictive value was determined as 87.8% and the negative predictive value as 89.74% as a result of the statistical analysis. According to Fisher's Exact test method, the p-value was found to be significant. viii These findings suggest that the developed antigen ELISA test, alongside existing test kits and RT-PCR methods, can be effectively used for CDV detection in our region.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    347707

    Köpeklerde Canine Distemper Virus enfeksiyonunun araştırılması

    Investigation of Canine Distemper Virus infection in dogs

    ELA ESİN

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2013

    Veteriner HekimliğiSelçuk Üniversitesi

    Viroloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. SİBEL YAVRU

  2. Tez No

    626943

    Antalya'daki köpeklerde canine distemper virus enfeksiyonunun araştırılması

    Investigation of canine distemper virus infection in dogs in theAntalya province

    YUSUF SAYIN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2019

    Veteriner HekimliğiAydın Adnan Menderes Üniversitesi

    Viroloji Ana Bilim Dalı

    DOÇ. DR. NURAL EROL

  3. Tez No

    905117

    Erzurum ili hayvan barınağında yaşayan köpeklerde Canine distemper Virüs enfeksiyonunun prevalansı ve risk faktörleri

    Prevalence and risk factors of Canine distemper Virus infection in dogs living in the animal shelter of Erzurum province

    KÜBRA ZENGİN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    Veteriner HekimliğiAtatürk Üniversitesi

    İç Hastalıkları (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı

    DR. ÖĞR. ÜYESİ NERGİS ULAŞ

  4. Tez No

    504099

    Klinik semptomlu köpeklerin kan, idrar, rektal sürüntü, nasal ve oküler akıntı örneklerinde canine distemper virus enfeksiyonun real time RT-PCR ile tespit edilmesi

    Investigation of canine distemper virus by real time RT-PCR technique in blood, urine, rectal swab, nasal and ocular discharge samples of dogs with clinical signs

    HASBİ SAİT SALTIK

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2018

    Veteriner HekimliğiMehmet Akif Ersoy Üniversitesi

    Viroloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MEHMET KALE

  5. Tez No

    844225

    Canine Distemper Virus ile doğal enfekte köpeklerde Canine Distemper Virüsu, Nectin 4 ve CD150 reseptörlerinin immunohistokimyasal, immunofloresan ve moleküler yöntemlerle araştırılması

    Investigation of Canine Distemper Virus, Nectin 4 and CD150 receptors by immunohistochemical, immunofluorescence and molecular methods in naturally infected dogs with Canine Distemper Virus

    HİLMİ NUHOĞLU

    Doktora

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    PatolojiKafkas Üniversitesi

    Patoloji (Veterinerlik) Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. ENVER BEYTUT

Geri Dön