Geri Dön

RSV, ınfluenza ve SARS-COV-2 için multipleks RT-PCR testi validasyonu

Validation of a multiplex rt-pcr assay for the detection of rsv, influenza and SARS-CoV-2

PDF İndir

  1. Tez No: 912712
  2. Yazar: ALİHAN BULGURCU
  3. Danışmanlar: PROF. DR. AYÇA ARZU SAYINER
  4. Tez Türü: Doktora
  5. Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
  6. Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
  7. Yıl: 2024
  8. Dil: Türkçe
  9. Üniversite: Dokuz Eylül Üniversitesi
  10. Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
  11. Ana Bilim Dalı: Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı
  12. Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
  13. Sayfa Sayısı: 114

Özet

Viral solunum yolu hastalıklarının önemli bir yük oluşturması, bu önemli viral patojenlerin hızlı bir şekilde tespit edilip tanımlanmasını gerekli kılmaktadır. İlk adımda üç yaygın patojenin (SARS-CoV-2, RSV, influenza A/B virüsü) eşzamanlı olarak test edilmesi ve gerektiğinde daha geniş bir panelin kullanılması, maliyet etkin bir yaklaşımdır. Bu çalışmanın birincil amacı, SARS-CoV-2, RSV ve influenza A/B virüslerini aynı anda test edebilen yeni bir ticari niteliksel multipleks qRT-PCR testi (Diagnovital® RTA Laboratories, Türkiye) doğrulamaktır. Nükleik asit testlerinde sentetik nükleik asit veya plazmid yerine tam virüs içeren standartların kullanılması, ekstraksiyon, ters transkripsiyon ve amplifikasyonu içerecek şekilde tanı testinin tüm basamaklarının gerçek yaşam koşullarında değerlendirilmesini sağlar. Solunum yolu virüsleri gibi bazı mikroorganizmalar için, nükleik asit testlerine yönelik ticari kantitatif standart materyalleri sınırlıdır. Bu çalışmanın ikincil amacı; influenza A, influenza B ve RSV için dijital PCR (dPCR) kullanarak kantitatif standartlar geliştirmek ve bunları qRT-PCR test validasyonunda kullanmaktır. Her virüs için analitik duyarlılık, her virüs için hazırlanan seyreltme serileri (10⁵-10¹ kopya/mL) kullanılarak Probit regresyon analizi ile hesaplandı. RSV, influenza A, influenza B RNA pozitif olduğu bilinen nazofarenjiyal sürüntü numunelerinin havuzlanması ile hazırlanan örneklerdeki virüs miktarı, ticari primer/prob setleri (Qiagen, infA-DMA00373, infB-DMA00374, RSV-DMA00379) kullanılarak dPCR (QIAcuity,Qiagen) yöntemi ile belirlendi. dPCR yönteminin influenza A&B ve RSV için analitik duyarlılık (LoD) ve kantitasyon alt sınırı (LoQ), çalışma içi ve çalışmalar arası tekrarlanabilirliği ve doğrusallığı belirlenerek bu viruslar için dPCR yöntemi de valide edildi. qRT-PCR validasyonu için analitik özgüllük, 120 negatif örnek ve diğer solunum yolu virüsleri için pozitif olan 32 örnek ile test edildi. RSV (n = 39), influenza A/B (n = 71), SARS-CoV-2 (n = 64) pozitif klinik örnekleri ve harici kalite kontrol panelleri doğruluk testi için kullanıldı. Tespit sınırına yakın konsantrasyondaki örnekler, iç-dış analizlerde tekrar edilebilirliği değerlendirmek amacıyla üçlü olarak çalıştırıldı. Influenza A, influenza B ve RSV için dPCR yönteminin LoD değerleri sırasıyla 93,75; 15,59 ve 15,38 kopya/mL olarak belirlendi. dPCR yönteminin çalışma içi tekrarlanabilirliği, düşük viral yüklü örneklerde daha yüksek olmak üzere 0,06-7,97 arası saptandı. Çalışmalar arası tekrarlanabilirlik 0,73-5,41 arası idi. İnfluenza A ve B için 3-4 log10, RSV için 7 log10 aralığında dilüsyonlar ile yapılan doğrusallık analizinde r2: 0,99 olarak bulundu. Diagnovital® testinin analitik duyarlılığı, SARS-CoV-2 Alfa ve Omikron varyantları, influenza A, influenza B ve RSV için sırasıyla 420.7, 296.7, 368.6, 1362.6, 1459.7 kopya/mL olarak bulunmuştur. Analitik özgüllük %100, CV% ise %5'in altında bulunmuştur. Yeni test, SARS-CoV-2, influenza A, influenza B ve RSV için pozitif örneklerin sırasıyla %100, %95.1, %97.5 ve %94.8'ini doğru şekilde tanımlamıştır. Sonuç olarak, havuzlanmış hasta örnekleri kullanılarak dPCR yöntemi ile influenza A, influenza B ve RSV için güvenilir kantitatif standartlar elde edildi. Bu standartlar ile ticari bir qRT-PCR testinin LoD ve tekrarlanabilirlik çalışmaları başarıyla gerçekleştirildi. Yeni multipleks qRT-PCR testinin validasyon analizi, testin tanı amaçlı kullanıma uygun olduğunu gösterdi. Düşük virüs düzeyine sahip bazı örneklerde yanlış negatif sonuçlar ortaya çıkabilir.

Özet (Çeviri)

The significant burden of viral respiratory diseases requires rapid detection and identification of important viral pathogens. Simultaneous testing for three common pathogens (SARS-CoV-2, RSV, influenza virus A/B) as a first step and using a broader panel as needed is a cost-effective approach. Our objective was to validate a new commercial qualitative multiplex qRT-PCR assay (Diagnovital® RTA Laboratories, Turkey) that can simultaneously test for influenza A/B, RSV and SARS-CoV-2. Standards containing whole viruses instead of synthetic nucleic acids or plasmids ensures that all steps of the assay being evaluated, including extraction, reverse transcription and PCR, are evaluated as in real life. For some microorganisms, such as respiratory viruses, commercial quantitative standard materials for nucleic acid tests are limited. The secondary aim of this study is to develop quantitative standards for influenza A, influenza B, and RSV using digital PCR (dPCR) and to utilize these standards in the validation of qRT-PCR tests. Analytical sensitivity for each virus was calculated by Probit regression analysis using dilution series (105-101 copies/mL) prepared for each virus. The amount of virus in the samples prepared by pooling nasopharyngeal swab samples known to be RSV, influenza A, influenza B RNA positive was determined by dPCR (QIAcuity, Qiagen) using commercial primer/probe sets (Qiagen, infA-DMA00373, infB-DMA00374, RSV-DMA00379). The analytical sensitivity (LoD) and lower limit of quantitation (LoQ), intra- and inter-study reproducibility and linearity of the dPCR method for influenza A&B and RSV were determined. Analytical specificity for qRT-PCR validation was tested with 120 negative samples and 32 samples positive for other respiratory viruses. External quality control panels and clinical specimens positive for RSV (n = 39), influenza A/B (n = 71), SARS-CoV-2 (n = 64) were used for accuracy (trueness) testing. Samples at concentrations near the limit of detection were run in triplicate for intra- and inter-assay precision analysis. LoD values of the dPCR method for influenza A, influenza B and RSV were 93.75 copies/mL, 15.59 copies/mL and 15.38 copies/mL, respectively. The within-run reproducibility of the dPCR method was determined to be between 0.06 and 7.97, being higher in samples with low viral load. Inter-run reproducibility was between 0.73 and 5.41. In the linearity analysis performed with dilutions between 3-4 log10 for influenza A and B and 7 log10 for RSV, R2 was found to be 0.99. Analytical sensitivity of the Diagnovital® assay was 420.7, 296.7, 368.6, 1362.6, 1459.7 copies/mL for SARS-CoV-2 Alpha and Omicron variants, influenza A, influenza B and RSV, respectively. Analytical specificity was 100%, while CV% was less than 5. The new assay correctly identified 100%, 95.1%, 97.5% and 94.8% of positive specimens for SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B and RSV, respectively. As a result, reliable quantitative standards were obtained for influenza A, influenza B and RSV by the dPCR method using pooled patient samples. LoD and reproducibility studies of a commercial qRT-PCR assay were successfully carried out with these standards. The validation analysis of the new multiplex qRT-PCR assay has shown that the test is suitable for use in the diagnostic setting. False negatives may occur in some samples with low levels of target virus.

Benzer Tezler

  1. Tez No

    842953

    SARS COV-2 / influenza A & B / RSV multipleks PCR tarama yaklaşımının, pediatrik hasta grubunda tanıya ve hasta yönetimine etkisinin değerlendirilmesi

    Impact of SARS CoV-2 / influenza A & B / RSV multiplex PCR screening on diagnosis and management of pediatric patients

    SULTAN GÜLBAHÇE ORHAN

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2023

    Enfeksiyon Hastalıkları ve Klinik MikrobiyolojiSağlık Bilimleri Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYŞE ESRA KARAKOÇ

  2. Tez No

    880710

    Çocuklarda üst solunum yolu enfeksiyon etkenlerinin multipleks pcr yöntemiyle araştırılması

    Investigation of upper respiratory tract infection agents in children by multiplex pcr

    TUĞBA TEKEREK

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2024

    MikrobiyolojiGaziantep Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. TEKİN KARSLIGİL

  3. Tez No

    781560

    Üst ve alt solunum yolu enfeksiyonu ön tanısı ile çeşitli kliniklerden gönderilen hasta numunelerinde viral patojenlerin araştırılması

    Investigation of viral pathogens in patient samples from various departments with pre-diagnosis of upper and lower respiratory tract infections

    BÜŞRA AYYILDIZ

    Tıpta Uzmanlık

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    MikrobiyolojiAtatürk Üniversitesi

    Tıbbi Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUHAMMET HAMİDULLAH UYANIK

  4. Tez No

    715834

    2020-2021 kış sezonunda SARS COV-2 ve diğer solunumsal virüslerin sürveyansı

    Surveillance of SARS COV-2 and other respiratory viruses in 2020-2021 winter season

    AYŞE BETÜL ŞAHİN

    Yüksek Lisans

    Türkçe

    Türkçe

    2022

    MikrobiyolojiSakarya Üniversitesi

    Mikrobiyoloji Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. MUSTAFA ALTINDİŞ

  5. Tez No

    815265

    Point-of-care detection of respiratory tract infections using a novel PCR kit with gold nanoparticle-mediated dna polymerase

    Altın nanopartikül aracılığıyla dna polimeraz güçlendirme yöntemi kullanan yeni bir PCR kitinin solunum yolu enfeksiyonlarının yatakta tanısına yönelik kullanımı

    MERT ELMAS

    Yüksek Lisans

    İngilizce

    İngilizce

    2023

    Biyolojiİstanbul Teknik Üniversitesi

    Nanobilim ve Nanomühendislik Ana Bilim Dalı

    PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ

Geri Dön