Sinkrotron X ışınları yöntemlerinin biyolojik makromolekül yapısı çözümlenmesinde kullanılması
Structural analysis of biological macromolecules by using synchrotron X ray scattering method
- Tez No: 91482
- Danışmanlar: PROF. DR. BEKİ KAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyofizik, Biophysics
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 1999
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Marmara Üniversitesi
- Enstitü: Sağlık Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyofizik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 122
Özet
-11- ÖZET Bu çalışmada sinkrotron X-ışm küçük açı saçılması (XSAS) ile çözeltideki proteinlerin yapısal özelliklerinin araştırılması amaçlandı. Deneyler için hücre sinyal ileti sisteminde temel rol oynayan heterotrimerik G-proteinlerinin sinir sisteminde en yaygın bulunan tipi olan G0-proteininin a-altbiriminin (Goo) rekombinant olarak E.coli7 den saflaştırılması denendi. Rekombinant Go«, Kcoli BL21(DE3) hücrelerinde pT7/Ndel/Goa vektörü kullanılarak sentezlendi. Ekspresyon seviyesi Western blot ve GTPyS bağlama yöntemleriyle belirlendi ve IPTG'den bağımsız olduğu saptandı. Protein izolasyonu çalışmalarına indüklenmemiş geniş ölçekli kültürlerde, Lee ve ark. tarafından verilen yöntem izlenerek başlandı. Saflaştırmanın her aşamasında, protein OD ölçümleri ile saptandı ve Goa'nın varlığı SDS-PAGE ve Goa'ya özgû bir antikor kullanılarak (NEN-Dupont) Western blot analizleriyle saptandı. Bazı kesimler GTPyS bağlama testleriyle de denendi. Bu çalışmalarda değişik aşamalarda Lee ve ark.'na uygun sonuçlar alınmadığından ve görülen safsızlıklar nedeniyle bazı değişiklikler yapıldı. Örneğin yüksek molekül ağırlığındaki proteinleri uzaklaştırmak amacıyla Gel Filtrasyon kromatografisi eklendi ve Q-Sefaroz kolonu Mono Q ile değiştirildi. Bu değişimler Goa ile aynı molekül ağırlığına sahip ve Kcoli glisin parçalama enzim sisteminin bir üyesi olan T-proteininin de Goa ile birlikte saflaşmasına yol açtı. Goa saflaştırma çalışmalarına paralel olarak X-ışınları küçük açı saçılma deneyleri için T-protein kullanıldı. Bu deneyler proteinin girasyon yarıçapının 2.58 nm olduğunu ve asimetrik bir yapıya sahip bulunduğunu gösterdi. T-proteini için elde edilen X-ışınlan saçılma deseni G-protein a-altbiriminden beklenilen desen ile m karşılaştırıldı. Analiz sonuçları bu proteinin yapısı ile GDP bağlı, aktif olmayan yapıdaki heterotrimerik bir kimerik G-proteininin a-altbiriminin yapısı arasında yüksek benzerlik olduğunu ortaya koydu. Goa proteininin saflaştırma yöntemini optimize etme ve T-protein şeklinin belirlenmesi çalışmaları sürmektedir.
Özet (Çeviri)
-111- STRUCTURAL ANALYSIS OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES BY USING SYNCHROTRON X-RAY SCATTERING METHOD SUMMARY Our aim in this study has been to determine structural properties of proteins using synchrotron X-ray small angle scattering (XSAS). Isolation of Goa, the a subunit of a major type of heterotrimeric G-protein in the nervous system was attempted for the measurements. Recombinant Goa was expressed in Kcoli BL21(DE3) cells transformed with pT7/Ndel/Goa plasmid. Expression levels were determined by Western blot analysis and GTPyS binding assays and it was established that the level of expression was not dependent on IPTG concentration. Protein isolation studies were initially carried out according to the method described by Lee et al. using large scale cultures which were not induced. At every step of purification, protein was detected by OD measurements and the presence of Goa was monitored by SDS-PAGE and Western blot analysis using commercial Goa antibody (NEN-Dupont). Some fractions were also assayed for GTPyS binding activity. Due to the inconsistencies with the results of Lee et al. and the presence of impurities in the final product, some modifications were introduced to this procedure. For example, to remove large molecular weight contaminants a gel filtration chromatography step was added and the Q-Sepharose column was replaced with Mono Q. These modifications resulted in co-purification of an Exoli protein of nearly the same molecular weight, the T-protein of glycine cleavage system.-IV- Parallel to Goa purification studies, T-protein was used for XSAS measurements. These measurements yield 2.58 om for the radius of gyration of T- protein and indicate that the protein has an assymetric shape in solution. The scattering pattern of T-protein was compared with that expected from a G-protein a subunit. Analyses indicate a high similarity between T-protein structure and the structure of GDP-bound inactive form of a-subunit of a chimeric heterotrimeric G- protein. Studies to optimize the purification of Goa and to determine the shape of T- protein are in progress.
Benzer Tezler
- Difraksiyon arttırımlı görüntüleme için matematiksel bir model
A mathematical model for diffraction enhanced imaging
MEHMET MURAT YAŞAR
Yüksek Lisans
Türkçe
2009
Fizik ve Fizik MühendisliğiHarran ÜniversitesiFizik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. ORAL OLTULU
- Structural and dynamical evolution of nanocrystals
Nanokristallerin yapısal ve dinamik gelişimi
CAN YILDIRIM
Yüksek Lisans
İngilizce
2013
Metalurji MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. YUNUS EREN KALAY
- Local structure and chemistry in marginal glass forming alloys
Metalik cam alaşımlarında lokal ve kimyasal yapı
TOLGA HAN ULUCAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2020
Metalurji MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiMetalurji ve Malzeme Mühendisliği Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. YUNUS EREN KALAY
- The controlled drift detector as an x-ray imaging device for diffraction enhanced imaging
X-ışınları görünteleme cihazı olarak kontrollü drift detektör?un kırınım yardımıyla kontrast?ı artırılmış görüntüleme?deki uygulanımı
ÇİĞDEM ÖZKAN
Yüksek Lisans
İngilizce
2009
Fizik ve Fizik MühendisliğiOrta Doğu Teknik ÜniversitesiFizik Bölümü
PROF. DR. ANDREA CASTOLDİ
PROF. DR. MELTEM SERİN
- 3 GeV enerjili sinkrotron ışınımı tesisinde kızılötesi ve X-ışını demet hatları için ışınım karakteristiklerinin ve araştırma tekniklerinin incelenmesi
Investigation of the characteristics and research techniques for infrared and X-ray beam lines in a 3 GeV synchrotron radiation facility
İREM GÖKBAYRAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2022
Fizik ve Fizik MühendisliğiAnkara ÜniversitesiFizik Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ÖMER YAVAŞ