Miyofibroblast farklılaşmasının düzenlenmesi ve bazı LncRNA'ların etkisinin araştırılması
The regulation of myofibroblast differentiation and the investigation of effect of some LncRNAs
- Tez No: 914947
- Danışmanlar: PROF. DR. FÜSÜN ÖZTAY
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoloji, Biology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2024
- Dil: Türkçe
- Üniversite: İstanbul Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 176
Özet
İdiyopatik pulmoner fibrozis, ilerleyici tipte, kronik ve ölümcül bir interstisiyel akciğer hastalığıdır. Miyofibroblastlar aşırı miktarda ekstrasellular matriks (ECM) elemanlarını üretip hücre dışına salgılayarak ECM elemanlarının interstisiyumda birikmelerini sağlayan, İPF moleküler patogenezinde etkili başlıca hücrelerdir. Bu nedenle, mevcut anti-fibrotik yaklaşımlarda fibroblast/miyofibroblast proliferasyonunun, farklılaşmasının önlenmesi, miyofibroblastların veya matrikste biriken ECM elemanlarının yok edilmesine yönelik uygulamalar yapılmaktadır. Pulmoner fibroziste, apoptoza direnç gösteren miyofibroblastların otofaji ile yok edilmesi hakkında çok az şey bilinmektedir. Çalışmada, bilinen anti-fibrotik yaklaşımlara alternatif olarak, kolşisin (CLC) kullanımıyla ECM elemanlarını taşıyan sekresyon vesiküllerinin hücre içinde mikrotübül aracılı taşınmalarının engellenmesi ve hücre içinde birikimlerinin sağlanması hedeflenerek, insan akciğer miyofibroblastlarında hücresel bir stresin yaratılması ve bu stresin hücrelerde anti-fibrotik bir yanıt oluşturulması amaçlandı. Ayrıca, anti-fibrotik yanıtı miyofibroblast farklılaşması, proliferasyonu ve ölüm mekanizmaları yönünden açıklamak ve fibrozisle ilişkili olduğu bilinen CD99P1, LINC00941, TUG1 ve TP53TG1 LncRNA'larının bu anti-fibrotik yanıta muhtemel katkılarını belirlemek amaçlandı. İnsan akciğer fibroblast hücrelerinden (MRC-5 hücreleri) 4 deney grubu oluşturuldu: I-kontrol grup; II- tek doz transforme edici büyüme faktörü (TGF)-β (5 ng/ml) ile miyofibroblast farklılaşması uyarılan grup; III- deneyin 0 ve 24. saatinde CLC (0,01 µM) uygulamaları yapılan grup ve IV-TGF-β+CLC uygulamaları yapılan grup. Madde uygulamalarını takiben deneyin 24, 48 ve 72. saatlerinde hücreler toplandı. CLC'nin etkin dozu MTT testi, mikrotübül depolimerizasyonu anti-α-tubulinin immunofloresan işaretleme yöntemi ve hücrelerin proliferatif yanıtı BrdU proliferasyon testi belirlendi. Miyofibroblast farklılaşması (α-SMA, hücre içi ve dışı kollagen ve fibronektin miktarları), miyofibroblastlarda apoptotik (aktif-kaspaz3, Bax ve survivin) ve otofajik yanıt (Beklin1, ATG-5, LC3BI-II çevrimi ve LAMP2), ve hücresel stres (Hsp70 ve Hsp90) ile ilişkili proteinlerin miktarlarındaki değişimler Western blot analizlerle saptandı. Nötral kırmızı boyası alımı ile lizozomal aktivite ve flörometrik yöntem ile hücre içi reaktif oksijen türlerinin miktarı analiz edildi. CD99P1, LINC00941, TUG1 ve TP53TG1 LncRNA'larının ve COL1A, FN1 ve ACTA2 genlerinin gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile ekspresyon analizleri yapıldı. Ayrıca, hücrelerde meydana gelen ultrastrüktürel değişimler geçirimli elektron mikroskobik analizler ile saptandı. TGF-β, MRC-5 hücrelerinde α-SMA protein miktarını (p
Özet (Çeviri)
Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive, chronic and fatal interstitial lung disease. Myofibroblasts are the main cells involved in the molecular pathogenesis of IPF by producing and secreting excessive amounts of extracellular matrix (ECM) elements and allowing their accumulation in the interstitium. Therefore, current anti-fibrotic approaches are aimed at preventing fibroblast/myofibroblast proliferation and differentiation, and eliminating myofibroblasts or ECM elements accumulated in the matrix. In pulmonary fibrosis, little is known about the autophagy-mediated destruction of apoptosis-resistant myofibroblasts. In the present study, as an alternative to known anti-fibrotic approaches, colchicine (CLC) was used to prevent microtubule-mediated intracellular transport of secretory vesicles carrying ECM elements and to ensure their accumulation in the cell. It was aimed to create a cellular stress and to induce an anti-fibrotic response in human lung myofibroblasts. It was also aimed to explain the anti-fibrotic response in terms of myofibroblast differentiation, proliferation and death mechanisms and to determine the possible contribution of CD99P1, LINC00941, TUG1 and TP53TG1 LncRNAs, which are known to be associated with fibrosis, to this anti-fibrotic response. Four experimental groups were established from human lung fibroblast cells (MRC-5 cells): I - control group; II - myofibroblast differentiation stimulated with a single dose of transforming growth factor (TGF)-β (5 ng/ml); III - CLC (0.01 µM) treated group at 0 and 24 h of the experiment; and IV - TGF-β+CLC treated group. Cells were harvested at 24, 48 and 72 h of the experiment following the substance treatments. The effective dose of CLC was determined by MTT assay, microtubule depolymerization by anti-α-tubulin immunofluorescent labeling method and proliferative response of cells by BrdU proliferation assay. Myofibroblast differentiation (α-SMA, intracellular and extracellular collagen and fibronectin levels), apoptotic (active-caspase3, Bax and survivin) and autophagic response (Beklin1, ATG-5, LC3BI-II cycle and LAMP2), and cellular stress (Hsp70 and Hsp90) related proteins were determined by Western blot analysis. Lysosomal activity was analyzed by neutral red dye uptake and intracellular ROS content was analyzed by fluorometric method. Expression analysis of CD99P1, LINC00941, TUG1 and TP53TG1 LncRNAs and COL1A, FN1 and ACTA2 genes were performed by RT-qPCR. In addition, ultrastructural changes in the cells were detected by transmission electron microscopy (TEM) analysis. In MRC-5 cells, TGF-β stimulated the production of α-SMA protein (p
Benzer Tezler
- İnsan pulmoner fibrozisinde etkili uzun kodlanmayan RNA'ların in vitro modelde belirlenmesi
The determination of effective long non-coding RNA on human pulmonary fibrosis in an in vitro model
MERVE YILDIRIM
- İnsan A549 hücre hattında sigara dumanı özütünün olumsuz etkileri
Adverse effects of cigarette smoke extract on the human A549 cell line
EZGİ SARI
- İnsan akciğer fibroblastlarında kollagen sekresyon vesiküllerinin taşınmasından sorumlu moleküllerin belirlenmesi
Identification of molecules responsible for the transport of collagen secretion vesicles in human lung fibroblasts
RESUL KIYMAZ
- Pulmoner nöroendokrin hücrelerin akciğer fibrozisi üzerinde muhtemel rolleri
Possible roles of pulmonary neuroendocrine cells on pulmonary fibrosis
ÖZGECAN KAYALAR
- İnterstisyel akciğer hastalıklarında serum periostin düzeyinin hastalığın ağırlığı ile ilişkisinin değerlendirilmesi
Evaluation of serum periostin levels and relationship for disease severity in interstitials lung diseases
SERPİL ŞAHİN
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2017
Göğüs HastalıklarıSağlık Bilimleri ÜniversitesiGöğüs Hastalıkları Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. GÜNGÖR ÇAMSARI