Bacillus izolatlarından fibrolitik enzimleri kodlayan genlerin klonlanması ve rekombinant bakterilerin silaj inokülantı olarak kullanım potansiyelinin belirlenmesi
Cloning of genes encoding fibrolytic enzymes from Bacillus isolates and determination of the potential use of recombinant bacteria as silage inoculants
- Tez No: 920736
- Danışmanlar: PROF. DR. BAHRİ DEVRİM ÖZCAN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyoteknoloji, Genetik, Ziraat, Biotechnology, Genetics, Agriculture
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Çukurova Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Zootekni Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Genetik Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 139
Özet
Bu tez çalışmasında, düşük pH koşullarında aktivite gösterebilen CMCaz enzimi üreten Bacillus suşları toprak örneklerinden izole edilmiştir. İzolatlar arasından ileri çalışmalar için seçilen Bacillus sp. KED3 bakterisinin 16S rRNA dizileme analizi sonucunda, Bacillus türleri arasında %99.63 oranında benzerlik ile Bacillus amyloliquefaciens ile yakından ilişkili olduğu belirlenmiştir. İzolat tarafından üretilen ve CMCaz-likenaz aktivitelerine sahip bifonksiyonel enzim üretiminden sorumlu olan gen pUC18 ve pUC18rA vektörleri ile sırasıyla E. coli JM109 ve Lactobacillus plantarum'a aktarılmıştır. Yapılan moleküler genetik analizler bifonksiyonel genin her iki bakteride de aktarıldığının doğrulanmasına karşın, rekombinant enzim aktivitesi E. coli'de gözlenirken, L. plantarum'da gözlenememiştir. Zimogram analizi sonucunda enzimin moleküler ağırlığı 31,78 kDa olarak hesaplanmıştır. Bifonksiyonel enzimin CMCaz aktivitesi pH 5.0'da maksimum seviyeye ulaşırken, likenaz aktivitesi pH 6.0'da maksimum seviyeye ulaşmıştır. Her iki enzim aktivitesi için de 60°C en optimum sıcaklık değeri olarak belirlenmiştir. Her biri 5 mM konsantrasyonlarda olan MnCl2, CaCl2, CuSO4, MgCl2 ve CoCl2 CMCaz aktivitesini değişik oranlarda artırırken; SDS ve EDTA inhibe etmiştir. CaCl2, CuSO4 ve MgCl2 likenaz aktivitesini değişik oranlarda artırırken; MnCl2, CoCl2, SDS ve EDTA inhibe etmiştir. Termal kararlılık analizleri, her iki enzimin de 40°C'de 15 dakika inkübasyondan sonra aktivitelerini tamamen koruduklarını, ancak 60°C'nin üzerinde aktivite kaybının başladığını göstermiştir. Her iki enzim aktivitesi de Bacillus sp. KED3 bakterisinde inokülasyonun başlangıcından itibaren 24. saatte maksimum seviyeye ulaşırken, rekombinant E. coli bakterisinde CMCaz aktivitesi 48., likenaz aktivitesi ise 96. saatte maksimum seviyeye ulaşmıştır. İnci darısı silajına rekombinant E. coli ilavesinin pH, kuru madde (KM), ham selüloz (HS), nötr deterjanda çözünmeyen lif (NDF) ve asidik deterjanda çözünmeyen lif (ADF) içerikleri üzerinde etkili olduğu gözlenmiştir. Rekombinant E. coli bakterisi ile muamele edilmiş olan silaj materyalinin pH değerinde düşüş, ham selüloz oranında azalma görülürken, silajın 21., 28. ve 35. günlerde yapılan analizlerde, rekombinant bakteri ilavesinin silajların kuru madde oranını azalttığı, bununla birlikte, ADF ve NDF içeriklerinde kısmi artışlara neden olduğu gözlenmiştir.
Özet (Çeviri)
In this thesis study, Bacillus strains that produce CMCase enzymes active under low pH conditions have been isolated from soil samples. Among the isolates, Bacillus sp. KED3 was selected for further studies and was found to be closely related to Bacillus amyloliquefaciens with 99.63% similarity based on 16S rRNA sequencing analysis. The gene responsible for the production of the bifunctional enzyme with CMCase and lichenase activities was cloned in E. coli JM109 and Lactobacillus plantarum using the pUC18 and pUC18rA vectors, respectively. Molecular genetic analyses confirmed the cloning of the bifunctional gene in both bacteria, although recombinant enzyme activity was observed in E. coli but not in L. plantarum. Zymogram analysis calculated the molecular weight of the enzyme as 31.78 kDa. The bifunctional enzyme's CMCase activity reached its maximum level at pH 5.0, while its lichenase activity peaked at pH 6.0. The optimum temperature for both enzyme activities was determined to be 60°C. MnCl2, CaCl2, CuSO4, MgCl2, and CoCl2 each at a concentration of 5 mM variously enhanced CMCase activity, whereas SDS and EDTA inhibited it. CaCl2, CuSO4, and MgCl2 enhanced lichenase activity at varying rates, while MnCl2, CoCl2, SDS, and EDTA inhibited it. Thermal stability analyses showed that both enzymes completely retained their activities after 15 minutes of incubation at 40°C, but activity losses began above 60°C. Both enzyme activities in B. amyloliquefaciens reached maximum levels 24 hours after inoculation, while in recombinant E. coli, CMCase activity peaked at 48 hours and lichenase activity at 96 hours. The addition of recombinant E. coli to pearl millet silage affected the pH, dry matter (DM), crude cellulose (CC), neutral detergent insoluble fiber (NDF), and acid detergent insoluble fiber (ADF) contents. The addition of recombinant bacteria resulted in a decrease in silage pH and crude cellulose content, while analyses at 21, 28, and 35 days showed a reduction in the dry matter content of the silage, with partial increases in ADF and NDF contents.
Benzer Tezler
- Bacillus izolatlarının fibrinolitik enzim aktivitesi yönünden taranması ve enzimin kısmi karakterizasyonu
Screening of the Bacillus isolates for fibrinolytic enzyme activity and partial characterization of the enzyme
BİRKAN SLEM
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyomühendislikEge ÜniversitesiBiyomühendislik Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RENGİN ELTEM
- Yerel Bacillus izolatlarından alfa amilazların klonlanması ve rekombinant amy28 alfa amilazının enzim özelliklerinin belirlenmesi
Cloning of amylases from local Bacillus isolates and determination of enzyme characteristics of recombinant amy28 alpha amylase
MERVE TUZLAKOĞLU ÖZTÜRK
Doktora
Türkçe
2013
BiyoteknolojiGebze Yüksek Teknoloji EnstitüsüMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. SALİHA İŞSEVER ÖZTÜRK
- Ostrinia nubilalis'in kültüre edilebilir bakteriyal florasının belirlenmesi ve mikrobiyal etkilerinin araştırılması
Investigation of culturable bacterial flora and microbial agent of Ostrinia nubilalis (Lepidoptera: Pyralidae)
EMRAH SAMİ SEÇİL
Yüksek Lisans
Türkçe
2010
BiyolojiKaradeniz Teknik ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. İSMAİL DEMİR
- Didesil dimetil amonyum klorür ve benzil dimetil amonyum klorür içeren bir antimikrobiyalin deriden izole edilen bakteriler üzerine etkisinin araştırılması
Examination of the effect of an antimicrobial containing didecyl dimethyl ammonium chloride and benzyl dimethyl ammonium chloride on the bacteria isolated from hide
CANAN VEYSELOVA
- Fındık bakteriyel yanıklık hastalığının [Xanthomonas arboricola pv. corylina (Miller et al.) Vauterin et al.] bakteriyel biyoajanlar kullanılarak mücadele imkânlarının araştırılması
Evaluation of biological control possibilities of bacterial blight in hazelnut caused by Xanthomonas arboricola pv. corylina (Miller et al.) Vauterin et al.] by using bacterial biocontrol agents
JOSE LUIS RODRIGUEZ GUTIERREZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
BiyoteknolojiAtatürk ÜniversitesiBitki Koruma Ana Bilim Dalı
PROF. DR. RECEP KOTAN