Investigation of asymmetric synthesis of chiral amines by biological oxidoreductase enzymes by computational methods
Biyolojik oksidoredüktaz enzimleri ile kiral aminlerin asimetrik sentezinin hesaplamalı kimya yöntemleri ile incelenmesi
- Tez No: 921591
- Danışmanlar: PROF. DR. NURCAN TÜZÜN
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Kimya, Chemistry
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Kimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 90
Özet
Kiral aminler; ilaçlar, zirai kimyasallar ve diğer özel bazı kimyasalların üretiminde önemli yapı taşları olarak yerini almaktadır. Enantiyo saf kiral aminler farmasötik kimya için son derece önemlidir. Bilhassa, kiral aminlerin ağrı kesici, tüberküloz ilaçları, Alzheimer's ilaçları ve depresyon ilaçları gibi ilaçlar açısından güçlü farmakoforlar olduğu bilinmektedir. Enantiyo saf kiral aminlerin kimyasal sentezinde toksik kimyasallar, çok sayıda yan ürünün oluşumu ve çok basamaklı sentezler gibi sorunlar gündemde yer almaktadır. Bu sorunlar değerlendirildiğinde enzimler yardımıyla kiral amin sentezi çevre dostu bir teknoloji olarak son yıllarda gerçekleştirilen çalışmalarda sıklıkla göze çarpmaktadır. Kiral amin sentezinde ꙍ-transaminazlar, monoamin oksidazlar, amin dehidrojenazlar, fenilalanin amonyum liyazlar, imin redüktazlar (IREDler), lipazlar, p450 monooksijenazlar, Pictet-Spenglerazlar ve Berberine köprü enzimleri gibi enzimlerin kullanıldığı bilinmektedir. Bunların içerisinden imin redüktazlar; NADPH bağımlı oksidoredüktazlar olup, prokiral iminlerin karşılık gelen aminlere asimetrik indirgenmesini katalizlemektedir. Tetrahidroizokinolinler (THIQler) kanser ilaçları, gut ilaçları, ağrı kesiciler ve çeşitli nörodejeneratif hastalıkların tedavisinde kullanılan ilaçların yapılarının omurgalarında yer almaktadırlar. Bu substitüye tetrahidroizokinolinler bir çok onaylanmış, doğal, sentetik ve yarı sentetik ilaçların yapılarına dahildir. Bu çalışmada Stackebrandtia Nassauensis kaynaklı SnIR enziminin 1-metil-3,4-dihidroizokinolin substratı üzerinde stereo seçiciliği in siliko yöntemlerle incelenmiştir. Li ve ekibi tarafından yapılmış olan deneysel çalışmada bahsi geçen enzimin ilgili substrat üzerinde çok yüksek oranda S seçici olduğu bildirilmiştir. Hesaplamalara öncelikle model çalışma ile başlanmıştır. Buradaki temel amaç kritik uzaklık ve açıları belirlemektir. Model çalışmada hesaplamalar suyun yardımı varlığında ve yokluğunda gerçekleştirilmiştir. Su yardımı olan model çalışmanın bariyeri su yardımı olmadan gerçekleşenden oldukça yüksek çıkmıştır. Çalışmaya su yardımı olmayan yapıdan devam edilmesine karar verilmiştir. Bilindiği gibi enzimler çok fazla sayıda atom ihtiva ettiğinden, bu yapılar ile kuantum mekanik hesaplamalar gerçekleştirmek son derece zordur. Bu noktada küme yöntemi adı verilen, enzimin aktif bölgesinin küçük bir modelinin oluşturulması marifetiyle enzimi modelleyecek bir yapı tasarlanır. DFT hesaplamalarında kullanılan küme, hem deneysel hem de hesaplamalı kanıtlara dayanan üç temel unsur kullanılarak oluşturulmuştur. Bunlardan ilki kristal yapı, ikincisi genel olarak IRED'lerin kinetiği ve mutasyonları da dahil olmak üzere deneysel veriler ve üçüncü olarak da moleküler yerleştirme sonucu elde edilen residü etkileşimleridir. Kuantum mekanik hesaplamaları gerçekleştirmek için oluşturulan küme modeli, yapısında aktif bölgedeki kritik rezidüleri ihtiva eder. Küme oluşturulması aşaması için öncelikli olarak ilgili enzim (PDB kodu: 6JIT) protein veri bankasından seçilmiştir. İlgili yapıda; substrat, kofaktör ve enzim yer almaktadır. Akabinde kümede yer alan kritik rezidülerin belirlenmesi adına enzim-substrat ve enzim-kofaktör etkileşimleri değerlendirilmiştir. PDB kodu 6JIT olan mevcut yapıda yer alan substrat çalışılacak substrattan farklı olduğundan dolayı koddaki mevcut substrat yapıdan silinerek yeni substrat için moleküler yerleştirme (doking) çalışması yapılmıştır. Moleküler yerleştirme sonucu yeni yapıda enzim, 1-metil-3,4-dihidroizokinolin substratı ve kofaktör yer almaktadır. Yeni yapı için enzim-substrat etkileşimleri değerlendirilmiştir. Kritik rezidülerin tespitinde ilaveten literatürden de yararlanılmıştır. Enzimin kesilmesi işlemi Cα'dan yapılmış olup, hidrojenlerle kapatılma işleminin akabinde uç atomlar dondurulmuş ve yapı optimize edilmiştir. Çalışmaya konu olan kümede nihai olarak 284 tane atom bulunmaktadır. Kümenin net yükü ise 0 olarak alınmıştır. Tüm geometri optimizasyonları için B3LYP fonksiyoneli yanında 6-31G(d,p) baz seti kullanılmış olup, tek nokta enerjileri ile yüksek seviyede geliştirmeler için wB97XD fonksiyoneli yanında 6-311+G(2df,2p) baz seti kullanılmıştır. Çözücü metodu olarak PCM seçilip dielektrik sabiti =4 olacak şekilde hesaplamalar yapılmıştır. Kuantum mekanik hesaplamar için Gaussian 16 programı kullanılmıştır. Optimizasyon sonrasında optimize olmamış küme ile optimize olmuş küme üst üste çakıştırılarak kritik rezidülerin pozisyonlarında değişiklik olup olmadığı incelenmiş olup, önemli bir değişiklik olmadığı tespit edilmiştir. Bu tespitin akabinde hazırlanan küme kullanılarak mekanizma hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. Kümenin çözücü etkilerinden etkilenmeyecek ölçüde yeterli büyüklükte alınıp alınmadığının tespiti için validasyon çalışması da yapılmıştır. Bu sebeple dielektrik sabitleri vakum, 4,0, 8,0, 16,0 ve 80,0 olacak şekilde ayarlanarak prokiral S konformer için hidrür transferleri modellenmiş ve tepkime enerjisinin dielektrik sabitine bağlı olarak neredeyse değişmediğinin görülmesiyle küme validasyonu da gerçekleştirilmiştir. Validasyon sonucu çevresel çözücü etkisinden etkilenmeyecek ölçüde yeterli büyüklükte bir küme oluşturulduğunu göstermiştir. İmin yapılarının amin yapısına dönüşümünde ikili bağın tekli bağa dönüşmesi için iki hidrojene ihtiyaç duyulduğu bilinmektedir. Bu çalışmada bu hidrojenlerden biri proton donör rezidüden gelen proton olup diğeri ise kofaktör olan NADPH'den gelen hidrürdür. Bu hidrojenlerin eş zamanlı gelmesiyle gerçekleşecek olan tek adımlı reaksiyon için bariyer hesaplanmış ancak bu bariyerin son derece yüksek olduğu ve bunun yanı sıra enzim kinetiği ile de uyumlu olmadığı değerlendirilmiştir. Tek adımlı reaksiyonun incelenmesinin akabinde çok adımlı reaksiyon incelenmiştir. Bu enzim reaksiyonu iki basamak olarak modellenmiştir. İlk basamak önceden de belirtildiği üzere proton donör rezidüden gelecek proton transferidir. Enzimin aktif bölgesinin yakınındaki protik bir rezidünün iminyum oluşumu aşamasında yer alabileceği varsayılmıştır. S tipi IRED'lerde bu proton verici rezidünün genellikle Tyr olduğu bildirilmiştir. Bu çalışma için bahsi geçen rezidü Tyr171'dir. Proton transferi sonrasında ikinci basamak birinci basamağın sonunda oluşmuş olan iminyum iyonuna hidrür transferidir. Birinci basamaktaki proton transferi için hem su yardımlı, hem de su yardımı olmadan bariyerler hesaplanmış olup, her iki durumda da bariyerin oldukça küçük ve birbirine çok yakın değerler çıktığı belirlenmiştir. Bu durumda, reaksiyonun birinci basamağının su yardımı alarak veya su yardımı olmadan da gerçekleşebileceğine karar verilmiştir. Bu çalışmada stereo seçiciliği etkileyen basamak ikinci basamak olup, ilaveten bu tez kapsamındaki hesaplamalar hızı belirleyen basamağın da ikinci basamak olduğunu göstermiştir. İminyum iyonuna hidrür transferiyle gerçekleşen ikinci basamakta R ve S geçiş konumu yapıları için olası konformerlerin analizi enzimin X-ışını yapısı da dikkate alınarak gerçekleştirilmiş ve her geçiş konumuna karşılık gelen enzim-substrat yapıları bulunmuştur. Elde edilen geçiş konumlarının enerjileri, enzim-substrat yapısı enerjileri ve ürün enerjileri hesaplanmıştır. Çıkan sonuçlardan yola çıkılarak bariyerler ve enzim-substrat komplekslerinin bağıl enerjileri değerlendirilmiştir. Hesaplamada kullanılacak başlangıç geometrileri oluşturulurken rezidüler ve NADPH, küme içinde kristal yapıdaki durumlarına göre yerleştirilmiş olup; hidrür transferinin geçiş durumu içinse substrat NADPH'ye göre uygun geometride pozisyonlandırılmıştır. Substratın NADPH'ye göre olası tüm yönelimleri, substrat için kristal yapı geometrisi göz ardı edilmeden yapılmıştır. Geçiş konumu yapıları, substrat azotunun Tyr171'e göre konumu ile modellenen enzim-substrat komplekslerinin bağıl enerjileri ve bariyerler göz önünde bulundurularak değerlendirilmiştir. Substrat azotunun Tyr171'e yakınlık ve uzaklık durumları incelenmiş olup; bu yapıların etkileşimler ve bariyerleri nasıl etkilediği değerlendirilmiştir. Bu çalışmadaki hesaplamalar, özellikle NADPH'nin amid grubundaki C=O ile substrat arasındaki hidrojen bağının geçiş durumu yapılarında bir stabilizasyon oluşturduğunu; bilhassa substrat izokinolini ve NADPH'nin piridin halkaları üst üste çakıştırıldığında görülen sterik etkilerin ve bu ikisi arasındaki kompleks etkileşimlerin stereo seçiciliği belirlediğini göstermiştir. Literatürdeki çalışmalar incelendiğinde genellikle S tip IREDlerde Tyr, R tip IREDlerde ise Asp'nin stereo seçicilik bakımından önemli olduğu görülmüştür. Bu bağlamda bu çalışmada da proton donör rezidü olan Tyr171 üzerinde mutasyon yapılmış ve Asp' ye döndürülmüştür. Yeni durumda bariyer enerjileri hesaplandığında stereo seçicilik bakımından bir değişiklik olmadığı fark edilmiştir. Çalışmanın bütünü incelendiğinde; reaksiyon mekanizması tüm aşamaları ve olası durumları ile detaylıca incelenmiş olup, iki basamaklı gerçekleştiği tespit edilmiştir. Bu tez kapsamında küme modeli ile gerçekleştirilen hesaplamalarda Li ve arkadaşlarının yapmış olduğu deneysel çalışmadaki stereo seçicilik ile uyumlu sonuçlar elde edilmiştir. İkinci basamağın stereo seçicilik için önemli olduğu ve hızı belirleyen basamak olduğu ifade edilmiştir. Bahsi geçen deneysel çalışmada herhangi bir mutasyon yapılmamış olup, literatürden yola çıkılarak yapılmış olan hesaplamalı mutasyon çalışmasında stereo seçicilikte değişiklik tespit edilmemiştir. Mevcut çalışma, ilaç endüstrisi için büyük bir öneme sahip olan 1-Metil-1,2,3,4-tetrahidroizokinolinin asimetrik sentezine odaklanmıştır. Araştırma, bu kadar büyük bir sistemde stereo seçicilik olgusunu atomistik bir yaklaşımla incelemek için değerli bir fırsat yaratmıştır. Konuyla ilgili mevcut literatürde bulunan diğer örneklerle birlikte ele alındığında, çalışmanın bu sistemlerin derinlemesine anlaşılmasını ve seçiciliğin istenen yönde ayarlanmasını sağlayacak yaklaşımların geliştirilmesini kolaylaştıracağı ileri sürülmektedir. IRED'leri kullanan asimetrik sentezlerde yapı-aktivite ilişkilerinin anlaşılmasının, bu tür süreçlerin uzun vadeli mühendisliğine önemli bir katkı sağlaması beklenmektedir.
Özet (Çeviri)
Chiral amines play a pivotal role as essential building blocks in the production of drugs, agricultural chemicals and some other special chemicals. Enantiopure chiral amines are of particular importance in pharmaceutical chemistry, as evidenced by their use as strong pharmacophores in various drugs, including pain relievers, tuberculosis drugs, Alzheimer's drugs and depression drugs. However, the chemical syntheses of these amines often entail significant challenges. These include the use of toxic chemicals, the formation of numerous by-products, and a multistage synthesis process, which has led to an increased focus on more environmentally friendly approaches. A promising solution that has gained prominence in recent studies is the use of chiral amine synthesis with the assistance of enzymes. It has been established that enzymes such as ꙍ-transaminases, monoamine oxidases, amine dehydrogenase, phenylalanine ammonium lyases, imine reductases (IREDs), lipases, p450 monooxygenases, Pictet-Spenglerases, and berberine bridge enzymes are employed in the synthesis of chiral amines. Of these, imine reductases, which are NADPH-dependent oxidoreductases, are of particular significance. These enzymes catalyze the asymmetric reduction of prochiral imines to the corresponding amines. Tetrahydroisoquinolines (THIQs) are a class of chemical compounds that has been identified in the structural frameworks of pharmaceutical drugs employed in the treatment of various medical conditions, including cancer, gout, pain management, and neurodegenerative diseases. These substituted tetrahydroisoquinolines are included in the structures of approved natural, synthetic, and semi-synthetic drugs. The present study investigates the stereoselectivity of the SnIR enzyme from Stackebrandtia Nassauensis on 1-methyl-3,4-dihydroisoquinoline substrate through in silico methods. In the experimental study by Li et al., it was reported that the aforementioned enzyme is highly S selective on the 1-methyl-3,4-dihydroisoquinoline substrate. The calculations were initiated with model work. The objective of the model study was to ascertain the critical distances and angles. The model study involved two distinct calculations: one with and one without the use of water. The barrier of the model study with water assistance was found to be considerably higher than that without water assistance. Consequently, it was determined that the subsequent analysis would be conducted without the use of water assistance. As it is known, it is extremely difficult to make quantum mechanical calculations with enzymes since these structures contain a large number of atoms. To address this challenge, a structure is devised to model the enzyme through the formation of a cluster, encompassing the critical residues and the reaction zone. The cluster that was utilized in the DFT calculations was formed using three principal elements, which were based on both empirical and computational evidence: 1. The crystal structure of SnIR 2. Experimental data including kinetics and mutations of IREDs in general 3. Residue interaction patterns from docking. For the cluster formation step, the IRED enzyme (PDB ID: 6JIT) was selected from the protein data bank. The relevant structure contains substrate, cofactor, and enzyme. Subsequently, enzyme-substrate and enzyme-cofactor interactions were evaluated in order to determine the critical residues in the cluster. Given that the substrate currently in the 6JIT structure differs from the substrate to be studied, molecular docking was performed for the new substrate by deleting the previous substrate from the structure. The molecular docking analysis of the new structure revealed the presence of the enzyme, 1-methyl-3,4-dihydroisoquinoline substrate, and the cofactor. Subsequently, an evaluation of the enzyme-substrate interactions within the novel structure was conducted to detect the critical residues. Additionally, a comprehensive review of the existing literature was conducted to determine the residues that should be included in the cluster model. Once the residues that were critical were determined, the cluster model was formed. Some of the residues used to construct the cluster for DFT calculations are included in their full form, while others are represented as backbones or side chains. The residues were generally cut from the Cα of their proceeding residue properly, ends capped with hydrogen atoms and the end atoms were frozen in their 3-dimensional geometry in the crystal structure of the enzyme during geometry optimization. The formed cluster model included 284 atoms and has a net charge of zero. In the quantum mechanical calculations, all geometry optimizations were executed with the 6-31G(d,p) basis set with the B3LYP functional. To refine the energies, the 6-311+G(2df,2p) basis set was employed with the wB97XD functional for single point energies. The polarizable continuum model (PCM) was selected as the solvent method, and calculations were executed with a dielectric constant of 4.0. The Gaussian 16 program was utilized for quantum mechanical calculations. Following optimization, a comparison was made between the non-optimized and the optimized clusters. An evaluation was conducted to ascertain whether a change in the position of critical residues had occurred. It was determined that no significant changes were present. During the conversion of imine to the amine structure, two hydrogens are needed to convert the double bond to single bond: One of these hydrogens is from a proton donor residue in the vicinity of the active site and the other is the hydride from the NADPH, which acts as a cofactor. The reaction was first considered as concerted and a corresponding mechanism was modelled where these hydrogens were transferred simultaneously. The barrier was found to be quite high and incompatible with the enzyme kinetics. Consequently, the stepwise reaction was examined. The stepwise reaction consists of two steps. The first step is the proton transfer from a proton donor residue. It is postulated that a protic residue in the vicinity of the active site of the enzyme may be involved in the iminium formation step. In S-type IREDs this proton donor residue was reported to be usually Tyr. In the second step of the reaction, hydride transfer takes place from NADPH to the formed iminium ion. In the first step, the proton transfer process was investigated, and the barriers were calculated for both scenarios: with and without the aid of water. The barriers were found to be very small and close to each other. Based on these findings, it was concluded that the initial step of the reaction could occur with or without the assistance of water. The second step was identified as both the rate-determining step, and the stereo selective step. The hydride transfer was subjected to comprehensive analysis through computational modelling. In constructing the input geometries for transition states, the residues and NADPH were held stationary in their crystal structure in the cluster and the substrate was positioned with respect to NADPH in a suitable geometry for a transition state structure for hydride transfer. All possible orientations of the substrate with respect to NADPH was spanned, without ignoring the crystal structure geometry for the substrate. All the transition states and the enzyme-substrate complexes were evaluated according to the position of the substrate nitrogen with respect to Tyr171, the corresponding barriers and the relative energies of the modelled enzyme-substrate complexes. The proximity of the substrate nitrogen to Tyr171, both in proximity and in its absence, has been demonstrated to effect interactions and the reaction barriers. The calculations presented in this study demonstrated that the hydrogen bonding (especially between the C=O oxygen of the amide group of NADPH and the substrate, which created a stabilization in the transition state structures) and steric effects (in particular, the overlap of the substrate isoquinoline and the NADPH's pyridine rings as a result of the hydride attack at Si vs Re faces of the substrate) and their complex interplay between the two are the most significant parameters that determine the stereoselectivity. A review of the literature revealed that Tyr is generally found to be important in terms of stereo selectivity for S-type IREDs, while Asp is found to be important for R-type IREDs. In this study, a mutation was introduced into Tyr171, the proton donor residue, converting it to Asp. Subsequent to this alteration, a recalculation of the barrier energies for the hydride transfer step revealed no discernible change in stereo selectivity. A thorough review of the study indicates that the reaction mechanism was meticulously examined, considering all its stages and potential outcomes. This detailed investigation led to the determination that the reaction occurred in two steps. The calculations performed on the hydride transfer step, which is the step that determines both the stereoselectivity and the rate, have demonstrated a preference for the S-product, in accordance with the experimental study conducted by Li et al. It is noteworthy that no mutation was introduced in the experimental study by Li and colleagues. The mutation study conducted exclusively through the in silico method in this thesis revealed no alteration in stereo selectivity. The present study has focused on the asymmetric synthesis of 1-Methyl-1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline, which is of considerable importance to the pharmaceutical industry. The research has created a valuable opportunity to study the phenomenon of stereoselectivity in such a large system with an atomistic approach. It is asserted that, when considered in conjunction with other examples found in the existing literature on the subject, this study will facilitate an in-depth understanding of these systems and the development of approaches that will enable the tuning of selectivity in the desired direction. The comprehension of structure-activity relationships in asymmetric syntheses employing IREDs is anticipated to offer a considerable contribution to the long-term engineering of such processes.
Benzer Tezler
- Yeni, rijit ve C-2 simetrik kiral makrosikliklerin sentezi ve enantiyomerik tanıma özelliklerinin 1H NMR titrasyon yöntemiyle incelenmesi
New, rigid and C-2 symmetrical chiral macrocycles synthesis and investigation of the enantiomeric recognation properties 1H NMR titration methods
DENİZ BARIŞ
- Aminonitril sentezinde çeşitli organokatalizörlerin etkinliğinin incelenmesi
Investigation of activities of various organocatalysts in aminonitrile synthesis
ÖZGE AYDIN
- Pridin içeren C2-simetrik makrosikliklerin sentezi ve moleküler tanıma özelliklerinin incelenmesi
Synthesis of C2-symmetric macrocycles containing pyridine and investigation of their molecular recognition properties
SEVİL ŞEKER
- Nitroalkenlere 1,4-katılması ve halkalaşma tepkimelerinin incelenmesi
Investigation of 1,4-addition reactions to nitroalkenes and subsequent cyclization reactions
SEDA ÇINAR
- Synthesis of novel chiral pyrrole derivatives as catalyst and their applications in asymmetric synthesis
Katalizör olarak yeni kiral pirol türevlerinin sentezi ve asimetrik sentezlerde uygulamaları
ALİME EBRU AYDIN
Doktora
İngilizce
2006
KimyaHacettepe ÜniversitesiOrganik Kimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CANAN ÜNALEROĞLU
PROF. DR. AYHAN SITKI DEMİR
