Geobacillus thermodenitrificans HBB268 lipazının saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of lipase from Geobacillus thermodenitrificans HBB268
- Tez No: 922248
- Danışmanlar: PROF. DR. KUBİLAY METİN
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Biyokimya, Mikrobiyoloji, Biochemistry, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Aydın Adnan Menderes Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Biyoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 166
Özet
Bu çalışma, Geobacillus thermodenitrificans HBB268 suşunun lipaz üretim kapasitesini optimize etmek, intrasellüler lipazın saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu sağlamak amacıyla yürütülmüştür. Lipaz üretimi üzerine besiyeri bileşenlerinin optimizasyonu PBD ve CCD istatiksel yöntemleri ile 18.27 g/L pepton, 18.41 g/L et ekstresi ve 1.26 g/L glikoz olarak belirlenmiş ve bu ortamda 18 saatlik inkübasyon sonunda maksimum 352 U/mL lipaz aktivitesine ulaşılmıştır. Saflaştırma adımlarında ilk olarak amonyum sülfat çöktürme yöntemi ile %60 doygunluk seviyesinde lipaz 3,05 kat saflaştırılmıştır. Devamında, lipaz Phenyl-Sepharose® CL-4B hidrofobik etkileşim kromatografisi ile 4 kat, Q Sepharose® iyon değişim kromatografisi ile 55 kat ve son olarak Bütil-Sepharoz kromatografisi ile 372 kat saflaştırılarak 5104.76 U/mL spesifik aktivite ölçülmüştür. . SDS-PAGE analizi, lipazın moleküler ağırlığını yaklaşık 55 kDa olarak tayin edilmiştir. Lipazın aktivitesi pH 7,00 ve 55 °C'de maksimum iken, stabilitesi pH 8,00-10,00 aralığında bazik ortamda sağlanmıştır. Kinetik analizler ile Vmax değeri 75,56 U/mL ve Km değeri 26,07 μM olarak belirlenmiştir, bu da enzimin p-nitrofenil laurat için yüksek substrat afinitesine sahip olduğunu göstermektedir. Lipaz aktivitesi +1değerlikli metal iyon varlığında büyük oranda korunmuştur. Ticari deterjanlarda Perwoll® %1 konsantrasyon lipaz stabilitesini anlamlı bir ölçüde korumuştur. Bunun yanında, lipaz deterjanla birlikte kullanıldığında pamuklu kumaşlardan yağ lekesi giderme etkinliğini düşük seviyede artırmıştır. Ayrıca, tiyol grubu indirgenlerinin lipaz aktivitesini artırdığı, tiyol grubu oksidanlarının ise aktiviteyi düşürdüğü gözlemlenmiştir. Lipazın aktif merkezinde katalizden sorumlu olan başlıca amino asitler sistein, triptofan ve serin olarak belirlenmiştir. Polihidrik alkollerden sorbitol lipazın termostabilitesini ve apolar çözücülerin lipazın stabilitesini arttırdığı gözlenmiştir.
Özet (Çeviri)
This study was conducted to optimize the lipase production capacity of Geobacillus thermodenitrificans HBB268 strain, as well as to purify and characterize the intracellular lipase. The optimization of medium components for lipase production was performed using PBD and CCD statistical methods, determining the optimal concentrations of 18.27 g/L peptone, 18.41 g/L meat extract, and 1.26 g/L glucose. Under these conditions, a maximum lipase activity of 352 U/mL was achieved after 18 hours of incubation. In the purification steps, lipase was initially 3.05-fold purified using ammonium sulfate precipitation at 60% saturation. Subsequently, the enzyme was purified further using Phenyl-Sepharose® CL-4B hydrophobic interaction chromatography (4-fold), Q Sepharose® ion exchange chromatography (55-fold), and finally Butyl-Sepharose chromatography (372-fold), resulting in a specific activity of 5104.76 U/mL. SDS-PAGE analysis determined the molecular weight of the lipase to be approximately 55 kDa. The maximum lipase activity was observed at pH 7.00 and 55 °C, while its stability was maintained in basic environments ranging from pH 8.00 to 10.00. Kinetic analyses revealed a Vmax of 75.56 U/mL and a Km of 26.07 μM, indicating that the enzyme has a high substrate affinity for p-nitrophenyl laurate. Lipase activity was largely preserved in the presence of +1-valent metal ions. In commercial detergents, Perwoll® at 1% concentration significantly preserved lipase stability. Additionally, lipase, when used with detergent, slightly increased its efficiency in removing oil stains from cotton fabrics. It was also observed that thiol group reductants enhanced lipase activity, whereas thiol group oxidants reduced it. The primary amino acids responsible for catalysis in the active site of the lipase were determined to be cysteine, tryptophan, and serine. Among polyhydric alcohols, sorbitol was found to enhance the thermostability of lipase, while apolar solvents increased its stability.
Benzer Tezler
- The effect of culture conditions on lipase production by Geobacillus thermodenitrificans HBB268
Geobacillus thermodenitrificans HBB268'in lipaz üretimi üzerine kültür koşullarının etkisi
PRINCESS SINDISWA SOKHULU
Yüksek Lisans
İngilizce
2022
BiyolojiAydın Adnan Menderes ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. KUBİLAY METİN
- Termofilik Geobacillus thermodenitrificans TH2 suşundan glukoz izomeraz enziminin saflaştırılması ve karakterizasyonu
Purification and characterization of glucose isomerase from a thermophilic bacterium, Geobacillus thermodenitrificans TH2
LEYLA KONAK
Yüksek Lisans
Türkçe
2011
BiyokimyaKaradeniz Teknik ÜniversitesiKimya Ana Bilim Dalı
PROF. DR. AHMET ÇOLAK
- Termofilik basillerin biyofilmlerindeki vejetatif hücrelerin ve sporların abiyotik çeşitli yüzeylere adezyonları ve tutunan bu hücre- sporların yüzeylerden eliminasyonu
Adhesion of vegetative cells and spores of Thermophilic bacilli biofilms on some abiotic surfaces and elimination of these cells- spores from the surfaces
AYŞE BÜŞRA KARAKAYA
Yüksek Lisans
Türkçe
2019
MikrobiyolojiAnkara ÜniversitesiBiyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ARZU ÇÖLERİ CİHAN
- Geobacillus türlerinde termostabil lipaz üretimi
Thermostable lipase production by Geobacillus species
MELİH KOÇ
- Molecular cloning, overexpression and biochemical characterization of bacterial amylase for biotechnological processes
Biyoteknolojik uygulamalarda kullanılmak üzere bakteriyel amilazın klonlanması, ifadelenmesi ve biyokimyasal karakterizasyonu
TÜLİN BURHANOĞLU
Yüksek Lisans
İngilizce
2012
Biyoteknolojiİzmir Yüksek Teknoloji EnstitüsüBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
YRD. DOÇ. DR. GÜLŞAH ŞANLI
YRD. DOÇ. DR. H. ÇAĞLAR KARAKAYA