Evaluation of the transcriptional level of bac operon in the bacilysin overproducer bacillus subtilis HWA strain and its physiological properties
Basilisini yüksek üreten bacillus subtilis HWA suşunda bac operon'un transkripsiyonel seviyesinin ve fizyolojik özelliklerinin değerlendirilmesi
- Tez No: 931521
- Danışmanlar: PROF. DR. AYTEN YAZGAN KARATAŞ
- Tez Türü: Yüksek Lisans
- Konular: Mikrobiyoloji, Microbiology
- Anahtar Kelimeler: Belirtilmemiş.
- Yıl: 2025
- Dil: İngilizce
- Üniversite: İstanbul Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Lisansüstü Eğitim Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Moleküler Biyoloji-Genetik ve Biyoteknoloji Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 93
Özet
Bacillus subtilis, çevresel koşullara dayanıklı, spor oluşturabilen ve çeşitli ikincil metabolitler üretebilen Gram-pozitif ve çubuk şeklinde bir bakteridir. Bu mikroorganizmanın en önemli metabolitlerinden biri olan basilisin, geniş spektrumlu antimikrobiyal aktiviteye sahip, ekstrem koşullarda olağanüstü stabiliteye sahip ve düşük molekül ağırlıklı bir dipeptid antibiyotiktir. Basilisin, endüstriyel biyoteknoloji alanında büyük potansiyele sahip olmasına rağmen, B. subtilis suşlarında doğal üretim düzeyinin düşük olması, basilisinin daha geniş uygulama alanlarının olmasını sınırlamaktadır. Bu durum, basilisin biyosentezini düzenleyen bac operonunun transkripsiyonel aktivitesinin yetersiz olmasıyla ilişkilendirilmektedir. Bu darboğazı aşmak için, daha önce çalışma ekibimiz tarafından bac operonunun transkripsiyonel seviyesini artırarak basilisin üretimini optimize etmek amacıyla CRISPR/Cas9 genetik mühendislik sistemi kullanılarak bac operonunun 5'-UTR bölgesi üzerinde modifikasyonlar gerçekleştirilmiş ve basilisin üretimini artmış olan B. subtilis HWA suşu geliştirilmiştir. Bu çalışma HWA suşunda basilisin üretimini transkripsiyonel düzeyde değerlendirmeyi ve HWA'daki fizyolojik değişiklikleri analiz etmeyi amaçlamıştır. HWA suşu, evcilleştirilmiş PY79 suşunun bir türevidir. HWA suşundaki düzenleme, optimize edilmiş bir ribozom bağlanma bölgesi eklemek için yapılmış ve mRNA stabilitesini ve translasyon verimliliğini ardırmayı hedeflemiştir. Bu çalışmanın temel hedefi doğrultusunda, geliştirilen B. subtilis HWA suşunda bac operonunun transkripsiyonel seviyesinin değerlendirilmesi ve yapılan genetik düzenlemelerin fizyolojik süreçlere etkisinin belirlenmesi için çalışma kapsamında, bac operonunun transkripsiyonel aktivitesi bacA::lacZ transkripsiyon füzyonu kurulmuştur ve transformantlar X-gal ve eritromisin-linkomisin içeren LB agar plakalar ile seçilmiştir. Seçilen transformant kolonilerinin mavi renkte görünmesi beklenmektedir. Bunun nedeni bacA::lacZ füzyon vektörünün tek parça-değişimi ile HWA'nın kromozomal DNA'sına insersiyonudur. İnsersiyon sonrasında lacZ gen ifadesi, transformantlarda X-gal'ın sindirimine yol açan enzim üretimini gerçekleştirip mavi renkli koloniler meydana getirmiştir. Seçilen transformantlara β-galaktosidaz aktivite testi uygulanmıştır. Transformant HWA suşları ve OGU1 suşu PA medyada büyütülerek belli zaman aralıklarında bac operon ifadesi ölçülmüştür. Ek olarak, bac operonunun transkripsiyonel aktivitesini ikinci bir marker olan yeşil floresan protein ile analiz etmek için, amyE::PbacA::gfp füzyonu oluşturularak transformantlar nişasta hidroliz testi ile seçilmiştir. Nişasta hidroliz testinin uygulanma amacı, transformantlarda kontrol suşa göre amilaz üretiminin görülemeyecek olması ve bu doğrultuda transformant etrafındaki nişastanın amilaz tarafından sindirilemeyecek olmasıdır. Transformantlarda amilaz üretiminin beklenmemesi, PbacA::gfp::cm transkripsiyonel füzyon vektörünün B. subtilis HWA'nın kromozomal DNA'sına entegrasyonunun, PbacA::gfp vektöründe bulunan her iki amyE lokusunun B. subtilis HWA suşunun kromozomal DNA'sındaki homolog bölgeleriyle homolog rekombinasyonu yoluyla meydana gelmesinden dolayı bu homolog rekombinasyonun, α-amilaz gen ifadesinin inhibisyonuna neden olmasından kaynaklanmaktadır. Transformantlardaki bac operonun promotör aktivitesi, transformantlar PA medyada 48 saat süre ile büyütülürken floresans mikroplaka analizleri ile ölçülmüştür. Transkripsiyonel aktivite, β-galaktosidaz aktivite testi ve yeşil floresans mikroplaka testi kullanılarak nicel olarak değerlendirilmiş, fizyolojik özellikler ise transformasyon verimliliklerinin, spor direnç özelliklerinin ve büyüme profillerinin karşılaştırılması ile analiz edilmiştir. Bulguların anlamlılığı eşleştirilmiş t-testleri ve ANOVA ile istatistiksel olarak doğrulanmıştır. Sonuç olarak, HWA suşunda bac operonunun transkripsiyonel aktivitesinde kontrol suşlarına kıyasla önemli bir artış olduğunu ortaya koymuştur. β-galaktosidaz aktivite sonuçları standardize edilmiş β-galaktosidaz miktarını elde edebilmek için Miller Unit hesaplanılarak karşılaştırılmıştır. β-galaktosidaz aktivite ölçümleri, HWA suşunda bacA::lacZ transkripsiyon füzyonu ifadesinde OGU1 suşuna kıyasla %39,9 daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur. bac operonunun transkripsiyonel aktivitesinin HWA suşunda 16. saatte zirve yaptığı ortaya konmuş ve durağan faz boyunca yüksek seviyelerde seyrettiği gözlemlenmiştir. Ayrıca, OGU1 suşunda bac operonunun transkripsiyonel aktivitesi 18. saatte zirve yapmıştır ve HWA suşunda olduğu gibi durağan faz boyunca yüksek seviyelerde seyretmiştir, ancak bu süre boyunca transkripsiyonel aktivite HWA suşu nispeten daha yüksek seyretmiştir. Diğer bir analiz yöntemi olan yeşil floresan analizlerinde, belli zaman aralıklarında yeşil floresan proteinden kaynaklanan floresan sinyalleri iki saat ara ile ölçülmüş olup rölatif floresan yoğunluğunun (RFI) absorbans değerlerine bölünmesi ile hesaplama yapılarak sonuçlar karşılaştırılmıştır. Bunun nedeni bac operon ifadesinin tanımlanabilmesidir. PbacA promotör aktivitesinin HWA suşunda özellikle durağan faz süresince PY79 suşuna kıyasla daha yüksek olduğu doğrulanmıştır. Zamansal analizler, HWA'daki bac operonunun transkripsiyonel aktivitesinin, eksponansiyel fazdan durağan faza geçişle paralel olarak daha erken zirveye ulaştığını ve büyüme süresi boyunca yüksek kaldığını göstermiştir. Her iki suş için en yüksek aktivite 19. saat civarında gözlemlenmiş olup, HWA-bac.gfp suşu, PY79-bac.gfp suşuna kıyasla yaklaşık %20 daha yüksek bacA promotör aktivitesi göstermiştir. Bu sonuçlar, CRISPR/Cas9 aracılığıyla yapılan 5'-UTR modifikasyonlarının basilisin biyosentezinde etkili olduğunu ve transkripsiyon verimliliğini artırdığını ortaya koymaktadır. Floresan mikroplaka analizi sonuçları ayrıca ortaya koymaktadır ki floresan mikroplaka analizi yöntemi bac operonun ifade düzeyini ilk ve hızlı ölçme metodu olarak kullanılabilir. Fizyolojik değerlendirmelerde, artan basilisin üretiminin kritik hücresel süreçler üzerinde olumsuz etki yaratmadığı ortaya konmuştur. HWA suşunun büyüme profili, PY79 ve rekombinant türevleriyle karşılaştırıldığında anlamlı bir farklılık göstermemiştir. Ek olarak, genetik modifikasyonların genel hücre büyümesine olumsuz bir etkisi olmadığı da ortaya konmuştur. Yüksek basilisin üretiminin B. subtilis HWA'daki transformasyon verimliliğinin etkilenip etkilenmediği PY79 suşu ile karşılaştırılarak değerlendirilmiştir ve HWA suşunun transformasyon verimi PY79 suşu ile kıyaslandığında biraz daha düşük olduğu bulunmuştur. Bu durum, yüksek basilisin üretiminin doğal transformasyon mekanizmasını etkileyebileceğini düşündürmektedir. Diğer bir fizyolojik değerlendirme testleri olan spor dayanıklılığı analizlerinde, HWA ve PY79 sporlarının farklı çevresel stres koşullarına karşı dayanıklılığını değerlendirmek amacıyla ısı, lizozim ve kloroforma karşı sporların dirençleri test edilmiştir. Elde edilen sonuçlarda, HWA ve PY79 suşlarının, ısı ve lizozime maruz kaldıklarında benzer direnç profilleri sergilediği ortaya konmuştur. Diğer taraftan, HWA sporlarının kloroforma karşı önemli ölçüde direnç artışı gösterdiği ve direncinin anlamlı şekilde yüksek olduğu gözlemlenmiştir. Önceki çalışmalar, basilisin üretiminin sporların kimyasal stabilitesini artırabileceğini öne sürmekte olup, bu çalışmada da benzer sonuçlar elde edilmiştir. Yüksek basilisin üretimi ile spor dayanıklılığı arasında güçlü bir ilişki olduğu gözlemlenmiştir. Bu çalışmanın en önemli katkılarından biri, 5'-UTR bölgesine yapılan genetik düzenlemelerin bac operonunun transkripsiyonel seviyesini artırarak basilisin üretimini optimize edebileceğini göstermesidir. Endüstriyel biyoteknoloji alanında antibiyotik üretimini artırmaya yönelik genetik mühendislik yaklaşımlarının giderek önem kazandığı düşünüldüğünde, sunulan stratejinin ölçeklenebilir ve verimli bir yöntem sunduğu açıktır. Gelecekteki çalışmalar, bu yöntemin farklı bakteriyel biyosentetik yollar üzerindeki etkilerini değerlendirebilir ve benzer genetik modifikasyonların diğer ikincil metabolitler üzerindeki etkisini araştırabilir. Bunun yanı sıra, basilisin üretim kapasitesinin daha da artırılabilmesi için promotör optimizasyon stratejileri, metabolik mühendislik ve sentetik biyoloji yaklaşımlarının birleştirilmesiyle daha yüksek verimlerin elde edilmesi sağlanabilir. Sonuç olarak, bu çalışma, bac operonunun genetik mühendislik ile modifikasyonunun basilisin üretimi üzerinde doğrudan etkili olduğunu göstermiştir. CRISPR/Cas9 kullanılarak gerçekleştirilen 5'-UTR düzenlemeleri, transkripsiyon verimliliğini artırmış ve basilisin biyosentez yolunun etkinliğini yükseltmiştir. Ayrıca, elde edilen sonuçlar, basilisin üretiminin spor dayanıklılığı ve transformasyon verimliliği gibi hücresel süreçlerle nasıl ilişkilendiğini anlamak açısından da önemli bir katkı sağlamaktadır. Gelecekte yapılacak çalışmalar, farklı biyoteknolojik uygulamalarda basilisin ve benzeri antimikrobiyal bileşiklerin üretim verimliliğini artırmaya yönelik daha kapsamlı stratejiler geliştirilmesine katkı sağlayabilir. Bu doğrultuda, sentetik biyoloji ve sistem biyolojisi yaklaşımlarının entegre edilmesiyle, basilisin üretiminin daha verimli hale getirilmesi mümkün olabilir. B. subtilis gibi endüstriyel mikroorganizmaların genetik mühendislik aracılığıyla nasıl optimize edilebileceğini göstermesi açısından bu çalışma önemli bir katkı sunmaktadır. Bu çalışma ayrıca, bac operonunun düzenlenmesiyle B. subtilis mikroorganizmasının yalnızca antibiyotik üretimi değil, genel fizyolojik dayanıklılığının da değiştirilebileceğini ortaya koymaktadır. Mikroorganizmaların çevresel stres faktörlerine karşı direnç geliştirmesi, biyoteknolojik üretim süreçlerinde avantaj sağlayabilir. İlerleyen çalışmalarda, bu tür genetik modifikasyonların sanayi ölçeğinde nasıl uygulanabileceği araştırılmalı ve farklı üretim sistemleri için en uygun koşullar belirlenmelidir. Özellikle fermentasyon süreçlerinde basilisin üretimini optimize etmeye yönelik substrat optimizasyonu ve besin ortamı düzenlemeleri gibi faktörler, biyoteknolojik üretim verimliliğini artırmak için değerlendirilebilir. Sonuç olarak, 5'-UTR modifikasyonu ile kurulan HWA suşundaki basilisin üretimindeki artış transkripsiyonel seviyede doğrulanmıştır ve güçlü-RBS yerleştirmesinin bac operonunun mRNA stabilitesini önemli ölçüde iyileştirdiğini görülmüştür. Genetik mühendislik uygulamaları, yalnızca antibiyotik üretimini artırmakla kalmayıp, bakterilerin genel fizyolojik dayanıklılığını da iyileştirme potansiyeline sahiptir. Bu nedenle, ilerleyen dönemlerde yapılacak araştırmalar, farklı mikroorganizmalar üzerinde benzer stratejilerin uygulanabilirliğini değerlendirmeli ve endüstriyel biyoteknoloji için en uygun yöntemleri geliştirmeye odaklanabilir.
Özet (Çeviri)
Bacillus subtilis is a Gram-positive, rod-shaped bacterium that produces bacilysin, a dipeptide antibiotic with broad-spectrum antimicrobial properties and exceptional stability under extreme conditions. Despite its industrial potential, the natural production of bacilysin in B. subtilis strains remains low, limiting its broader application. To overcome this bottleneck, this study aimed to evaluate the bacilysin production in transcriptional level in B. subtilis HWA which was constructed previously by our study team, and to evaluate the physiological changes in HWA. The HWA strain, a derivative of the domesticated PY79 strain, was previously developed through CRISPR/Cas9-mediated editing of the 5'-UTR of the bac operon to introduce an optimized ribosome-binding site. This modification was designed to improve translation efficiency. To assess transcriptional activity, bacA::lacZ transcriptional fusion was introduced into the HWA, and amyE::Pbac::gfp transcriptional fusion was introduced into the HWA and PY79 strains. Transcriptional activity was quantified using β-galactosidase assays and green fluorescence measurements, while physiological traits, including transformation efficiency, spore resistance properties, and comparison of the growth profiles, were evaluated. The findings were statistically analyzed using paired t-tests and ANOVA to confirm the significance of observed differences. The results revealed a substantial increase in bac operon transcriptional activity in the HWA strain compared to its parental strains. β-galactosidase activity peaked at the 16th hour in HWA and peaked at the 18th hour in its control strain OGU1 (bacA::lacZ::erm), yet following the initial peak, a gradual decline in expression of bacA-lacZ fusion was observed in both strains with higher bac operon expression in HWA than bac operon expression in OGU1 throughout the time points. Green fluorescence assays confirmed these findings, with the HWA strain exhibiting consistently higher Pbac promoter activity than PY79, particularly during the stationary growth phase. Temporal analyses demonstrated that the transcriptional activity of the bac operon in HWA peaked earlier, aligning with the transition from exponential to stationary phases, and remained elevated throughout the growth period. These results indicated that the 5'-UTR modifications successfully enhanced transcriptional efficiency in HWA. Physiological evaluations showed that the enhanced bacilysin production did not adversely affect critical cellular processes. Growth profiles revealed no significant differences between HWA, PY79, and their recombinant derivatives, indicating that the genetic modifications did not impact overall growth dynamics. Similarly, transformation efficiency and spore quality assays demonstrated that there is no significant change in transformation efficiency and resistance to heat and lysozyme treatments in HWA and PY79. On the other hand, a significantly-increased resistance to chloroform was also observed in HWA. In conclusion, this study highlights the potential of 5'-UTR engineering in enhancing secondary metabolite biosynthesis in B. subtilis. By integrating transcriptional and physiological data, it provides a comprehensive understanding of the effects of targeted genetic modifications. The approach demonstrated here offers a scalable and efficient strategy to optimize the production of high-value bioactive compounds like bacilysin, with significant implications for industrial biotechnology. Future research could explore the broader applicability of this strategy to other biosynthetic pathways and microbial systems.
Benzer Tezler
- Kordon kanından elde edilen hematopoietik kök hücrelerin myeloid seriye farklılaştırılması sırasında Tbx3 protein düzeyinin değerlendirilmesi
Evaluation of Tbx3 protein level during differentiation of hematopoietic stem cells obtained from cord blood to myeloid series
ÜMMÜ GÜLŞEN BOZOK
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2018
FizyolojiAkdeniz ÜniversitesiFizyoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. VECİHE NİMET UYSAL
- Evaluation of microrna sequence composition and expression
Mikrorna'ların dizi bileşenleri ve ifade düzeylerinin araştırılması
KORAY DOĞAN KAYA
Yüksek Lisans
İngilizce
2005
Biyolojiİhsan Doğramacı Bilkent ÜniversitesiMoleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Y.DOÇ.DR. CENGİZ YAKICIER
Y.DOÇ.DR. ÖZLEN KONU
- Evaluation of YB-1 transcriptional factor, DNA glycosylase hNTH1 and human topoisomerase I functions in relation to drug resistance and DNA repair mechanisms
YB-1 transkripsiyon faktörü, DNA glikozilaz hNTH1 ve insan topoizomeraz I enzimi işlevlerinin ilaç direnci ve DNA tamir mekanizması kapsamında değerlendirilmesi
MÜGE ŞENARISOY
Doktora
İngilizce
2018
BiyokimyaEge ÜniversitesiBiyoteknoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. ZEKİ TOPÇU
DR. JOANNA TIMMINS
- Prostat kanseri hücrelerinde resveratrol analoğunun anti-kanser etkinliğinin in vitro değerlendirilmesi
Evaluation of anti-cancer efficiency of resveratrol analogue on prostate cancer cells in vitro
BESRA ÖZMEN YELKEN
- Ratlarda miringotomi sonrası uygulanan topikal halofuginonun miringotomi kapanma süresine ve miringoskleroza etkisi
The effects of topically applied halofuginone after myringotomy on myringosclerosis and myringotomy closure time in rats
TANER ÖZDEMİR