DNA dizi analizi yöntemleri ile sonuç alınamayan genetik hastalıklarda m-RNA dizileme yöntemi ile moleküler etiyolojinin araştırılması
Investigation of the molecular etiology in genetic disorders undiagnosed by DNA sequencing methods through mRNA sequencing analysis
- Tez No: 933246
- Danışmanlar: DOÇ. DR. TİMUR TUNCALI, PROF. DR. HATİCE ILGIN RUHİ
- Tez Türü: Tıpta Uzmanlık
- Konular: Endokrinoloji ve Metabolizma Hastalıkları, Genetik, Moleküler Tıp, Endocrinology and Metabolic Diseases, Genetics, Molecular Medicine
- Anahtar Kelimeler: RNA dizileme, idrar derive hücre, derin intronik varyant, ekspresyon, RNA sequencing, urine-derived cells, deep intronic variant, expression
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Ankara Üniversitesi
- Enstitü: Tıp Fakültesi
- Ana Bilim Dalı: Tıbbi Genetik Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Belirtilmemiş.
- Sayfa Sayısı: 111
Özet
Giriş ve amaç: Genetik hastalıklarda, moleküler tanı için çoğunlukla tek gen dizileme, hedefli paneller, tüm ekzom dizileme gibi yöntemler kullanılır. Ancak, bu yöntemler derin intronik varyantları, yapısal değişiklikleri ve klinik önemi belirsiz varyantların klinik etkilerini belirlemede yetersiz kalabilir. Prenatal tanı veya preimplantasyon genetik tanı (PGT), kalıtsal hastalıklara sahip ailelerin sağlıklı çocuk sahibi olmasını sağlayabilir. Kalıtsal bir hastalığı olan veya kalıtsal bir hastalık için taşıyıcı olduğu bilinen evli çiftlerin; sağlıklı bebek sahibi olması için uygulanan PGT ve yardımcı üreme tekniklerine yönelik geri ödeme kapsamındaki hastalık listesi, 1 Ağustos 2021 tarihinde güncellenen Sağlık Uygulama Tebliği ile genişletilmiş ve bazı metabolik hastalıklar eklenmiştir. Antisense oligonükleotidler, U1-snRNA modülasyonu, kırpılma mutasyonları taşıyan hastalarda araştırma ve geliştirmesi devam etmekte olan tedavi yöntemleridir. Bu tedavi yöntemlerine uygunluğunun belirlenebilmesi için ve prenatal tanının endike olduğu olgularda, mutasyonun moleküler genetik yöntemler ile gösterilmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, DNA dizi analizi yöntemleri ile sonuç alınamayan genetik hastalık tanısının net olduğu olgularda m-RNA dizileme yöntemi ile incelenerek moleküler etiyolojinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Gereç ve Yöntem: Çalışmaya rutin genetik testler ile tanı alamayan 15 olgu dahil edilmiştir. RNA eldesi için periferik kan, periferik kan mononükleer hücreleri, fibroblast ve idrar kullanılmıştır. RNA izolasyonu sonrasında m-RNA dizileme çalışma yapılmıştır. Çalışma sonucunda saptanan RNA değişiklikleri doğrulanmış ve değişikliğe neden olan mutasyon belirlenerek, aile içinde segregasyon çalışması uygulanmıştır. Bulgular: Çalışmaya alınan 8 olguda RNA değişikliği tespit edildi. Bu değişiklikler sonucunda GNPTAB, HLCS, GLB1, FBXL4 genlerinde derin intronik varyantlar, bir olguda IDS-IDSP1 yeniden düzenlenmesi ve IDS-EOLA1 füzyon geni, bir olguda GLB1 geninde heterozigot ekzon delesyonu, MSUD tanılı daha önce yapılan dizi analizi incelemelerinde yanlış negatif sonuç verilen bir olguda BCKDHA homozigot ekzon delesyonu, mitokondriyal hastalık düşünülen bir olguda 5'UTR bölgesindeki RNA değişikliği gösterilerek bozulmuş uORF mekanizması, KCNQ1 geninde ardışık ekzon atlamaları ve CDKN1C geninde ifade değişikliği saptanarak hastaların klinik bulgularının genetik olarak açıklanmasına katkıda bulunuldu. Sonuç: Çalışmada tespit edilen intronik varyantlar ilgili genlerde tanımlanmış ilk derin intronik varyantlardır. Ayrıca çalışmamız idrardan derive hücre kültürü ile RNA dizileme yapılan Türkiye'deki ilk çalışmadır. RNA dizileme, tüm ekzom dizileme ve tüm genom dizileme yöntemlerinin sınırlılıklarını aşabilmesi (derin intronik varyantlar, heterozigot ekzon delesyonları gibi) ile analiz edilmesi zor bölgelerin fonksiyonel olarak incelenmesini sağlaması (5'UTR gibi) nedeniyle moleküler tanısı konamamış genetik hastalıklarda güçlü bir alternatiftir. Hastaların moleküler tanısına katkı vererek, prenatal tanı-preimplantasyon genetik tanıdan ve kırpılmayı modüle eden tedavi olanaklarından faydalanması sağlanır. Ayrıca, hasta kliniğiyle ilişkilendirilemeyen bir varyant bulunması veya ilgili gende herhangi bir varyant bulunmaması durumunda da gen ekspresyon analizleri tanıya katkı sağlayabilir. RNA dizileme, tanı için tek başına veya diğer yöntemlerle (tüm ekzom dizileme, tüm genom dizileme, optik haritalama) kombine olarak kullanılabilir.
Özet (Çeviri)
Introduction and Aim: Genetic diseases can occur through chromosomal anomalies or mutations in DNA and can be inherited. Methods such as single-gene sequencing, targeted panels, and whole exome sequencing are used for molecular diagnosis. However, these methods may be inadequate in detecting deep intronic variants, structural changes, and determining the clinical effects of variants of uncertain significance. Prenatal diagnosis or preimplantation genetic diagnosis (PGD) can enable families with hereditary diseases to have healthy children. The list of diseases covered by reimbursement for PGD and assisted reproductive techniques applied to enable couples who have or are known to be carriers of a hereditary disease to have a healthy child was expanded with the inclusion of certain metabolic disorders through the updated Healthcare Implementation Communiqué on August 1, 2021. Antisense oligonucleotides and U1-snRNA modulation in patients with splicing mutations are treatment methods still under research and development. For these treatment methods to be applied and in cases where prenatal diagnosis is indicated, the mutation must be demonstrated by molecular genetic methods. In this study, it is aimed to determine the molecular etiology by examining genetic disease cases with no results from DNA sequencing methods through mRNA sequencing. Materials and Methods: Fifteen cases that could not be diagnosed with routine genetic tests were included in the study. Peripheral blood, peripheral blood mononuclear cells, fibroblasts, and urine were used for RNA extraction. Results: RNA changes were detected in 8 cases. As a result of these changes, deep intronic variants were identified in the GNPTAB, HLCS, GLB1, and FBXL4 genes. Additionally, IDS-IDSP1 rearrangement and IDS-EOLA1 fusion gene were detected in one case, heterozygous deletion in the GLB1 gene in another, and a homozygous exon deletion in the BCKDHA gene in a case previously diagnosed with MSUD that had been falsely reported as negative in previous sequence analysis studies. Furthermore, in a case suspected of mitochondrial disease, RNA changes in the 5'UTR region were shown to disrupt the upstream ORF mechanism. Consecutive exon skipping in the KCNQ1 gene and expression changes in the CDKN1C gene were identified, contributing to the explanation of patients' clinical findings. Conclusion: The identified variants are the first deep intronic variants defined in the relevant genes. Additionally, our study is the first in Turkey to perform RNA sequencing using urine-derived cell culture. RNA sequencing is a powerful alternative in undiagnosed genetic diseases due to its ability to overcome the limitations of whole exome sequencing and whole genome sequencing methods (such as deep intronic variants and heterozygous exon deletions) and to provide functional analysis of difficult-to-analyze regions (such as the 5'UTR). Furthermore, gene expression analysis can contribute to diagnosis if a variant unrelated to the patient's clinical findings is found or if no variant is found in the relevant gene. RNA sequencing can be used for diagnostic purposes either alone or in combination with other methods such as whole exome sequencing, whole genome sequencing, or optical mapping.
Benzer Tezler
- Türkiye yerli sığır ırklarında mitokondriyal DNA polimorfik yapılarının PCR-RFLP ve DNA dizi analizi yöntemleri ile incelenmesi
Analysis of mitochondrial DNA polymorphic sites with PCR-RFLP and DNA sequencing methods in Turkish native cattle breeds
MEMİŞ ÖZDEMİR
- Metastatik kolorektal karsinomlarda tümör dokusunda K-ras gen mutasyonun RT-PCR ve DNA dizi analizi yöntemleri ile tespiti ve klinik parametreler ile ilişkisi
Detection of K-ras gene mutation in tumour tissue in metastatic colorectal carcinomas by RT-PCR And DNA sequence analysis and its association with clinical parameters
GAZİ ÇÖMEZ
Tıpta Uzmanlık
Türkçe
2010
OnkolojiGaziantep Üniversitesiİç Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF. DR. CELALETTİN CAMCI
- Ailesel meme ve meme-over kanserli Türk hastalarda BRCA1 ve BRCA2 genlerindeki mutasyonların, konformasyona duyarlı jel elektroforezi (CSGE), protein truncation test (PTT) ve DNA dizi analizi ile belirlen
Mutation analysis of BRCA1 and BRCA2 Turkish breast and breast-ovarian cancer families by conformation sensitive gel electrophoresis protein truncation test and DNA sequencing
AYŞE BALCI
Doktora
Türkçe
1999
Tıbbi BiyolojiGazi ÜniversitesiTıbbi Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
DOÇ. DR. ABDULLAH EKMEKÇİ
- Leishmania infantum DNA aşısı adayı LACK geninin klonlanması
Cloning DNA vaccine candidate LACK gene of leishmania infantum
SERKAN KARACA
Yüksek Lisans
Türkçe
2013
ParazitolojiErciyes ÜniversitesiParazitoloji Ana Bilim Dalı
PROF. DR. SALİH KUK
- Çeşitli klinik örneklerden izole edilen candida albicans suşlarının genotipik dağılımı
Genotypic distribution of clinical isolates of candida albicans
ZEYNEP CEREN KARAHAN
Yüksek Lisans
Türkçe
2004
Moleküler TıpAnkara ÜniversitesiÇocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı
PROF.DR. NEJAT AKAR