Avokado meyvesinden afinite kromatografisi kullanılarak yüksek saflıkta polifenol oksidaz enziminin elde edilmesi ve biyokimyasal karakterizasyonu
Purification of polyphenol oxidase enzyme with high purity from avocado by using affinity chromatography and its biochemical characterization
- Tez No: 941781
- Danışmanlar: PROF. DR. EMİNE KARAKUŞ
- Tez Türü: Doktora
- Konular: Biyokimya, Biochemistry
- Anahtar Kelimeler: Polifenol oksidaz, avokado, enzimatik esmerleşme, saflaştırma, afinite kromatografisi, Avocado (Persea americana), characterization, isolation, affinity chromatography, polyphenol oxydase
- Yıl: 2025
- Dil: Türkçe
- Üniversite: Yıldız Teknik Üniversitesi
- Enstitü: Fen Bilimleri Enstitüsü
- Ana Bilim Dalı: Kimya Ana Bilim Dalı
- Bilim Dalı: Biyokimya Bilim Dalı
- Sayfa Sayısı: 133
Özet
Avokado, dünya üzerinde en besleyici meyveler arasında kabul edilmektedir. Avokado ilk olarak Orta Amerika'da keşfedilmiştir. Tropikal bir meyve olan avokado, lifler, proteinler, vitaminler, antioksidanlar ve mineraller bakımından çok zengin bir değere sahiptir. Ancak avokado içerisinde oldukça yüksek bir miktarda mevcut olan polifenol oksidazı (PFO) enzimi meyvenin kahverengi olmasına neden olan temel faktördür. PFO enzimi fenolik bileşiklerin oksidasyonunu katalize eder ve bu süreçte de kahverengi pigmentler oluşur. Bu tez çalışmada, avokado meyvesinden PFO enziminin kısmi saflaştırılması ve karakterize edilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Bu çalışma kapsamında, toplam PFO aktivitesi ölçülmüş, kinetik parametreler incelenmiş ve afinite kromatografi ile PFO enziminin saflaştırılması gerçekleştirilmiştir. Protein miktarı, Bradford yöntemi kullanılarak ölçülmüş ve standard olarak sığır serum albumini kullanılmıştır. Saflaştırma işlemi ise, sırayla amonyum sülfat çöktürmesi (0-80 %), dializ ve afinite kromatografi adımlarını içermiştir. PFO enzim aktivitesi Katekol, 4-metil Katekol, Pirogallol, Klorogenik asit ve Kafeik Asit substratları kullanılarak test edilmiştir. Katekol substratı için en uygun reaksiyon koşulları 0.1 M konsantrasyon, pH 7,2 ve 37°C olarak belirlenmiştir. Katekol substratı enzim aktivitesinin 6-9 pH arasında anlamlı bir şekilde arttığı, testlerde görülmüştür. Tez çalışmasında, ayrıca PFO enzimi saflaştırmak iki farklı Afinite jeller Sefaroz 4B-L-Tirozin-p-aminobenzoik asit ve Sefaroz 6B-L-Tirozin-p-aminobenzoik asit, sentezlenmiştir. Bu jeller sırasıyla 147.73 ve 154.00 saflaştırma katlarına ulaşmıştır. Bu elde edilen enzimlerin kinetik özellikleri karşılaştırılarak incelenmiştir. PFO enzimi yapısal ve moleküler özellikleri Sodyum Dodesil Sülfat -Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) ve Doğal Poliakrilamid Jel Elektroforezi (Native-PAGE) teknikleri ile incelenmiştir. SDS-PAGE analiz çizelgesi kullanılırken, 4B jelinden PFO şeritleri izole jeli 35-50 kDa arasında belirlenirken, 6B jelinden PFO bantları 50 kDa belirgin ve 35 kDa hafif bulunmuştur. Bantları Native PFO analizde her iki jeli değişik 50-70 kDa ve 100 kDa aralığında kesin ve hafif şekilde belirlenmiştir. Bu çalışma, Avokado PFO'nun Sefaroz 6B-L-Tyrosine-p-aminobenzoik asit kullanılarak ilk kez afinity kromatografisi ile saflaştırılması ve bu jel ile yapılan kapsamlı bir analiz sunması nedeniyle literature katkısı nedeniyle önemlidir. Ayrıca, PFO enzim aktivitelerinin farklı substratlar ve pH aralıklarında gösterdiği davranışlar detaylı bir şekilde değerlendirilmiştir.
Özet (Çeviri)
Avocado fruit is one of the most nutrient-dense fruits, originating from Central America, and was a significant part of natives' diets for over 5,000 years. This tropical fruit is rich in protein, fibre, antioxidants, vitamins and minerals. But what is the secret of these fruits that cause such beautiful and pleasant color reactions in them? Avocados are rich in PPO Enzymes (Polyphenol Oxidase), so they are sensitive to browning reactions. PPO enzyme catalyses the oxidation of phenolic compounds, due to which the end product will polymerize into brown pigments. The objective of the present work is to partially purify and characterize the PPO enzyme of the avocado fruit. This main aims were determining overall PPO activity, kinetic parameters, and purification of the PPO enzyme by affinity chromatography. Protein contents were quantified using the Bradford method with bovine serum albumin as standard. Protein purification was achieved using ammonium sulfate precipitation (0–80%), dialysis and affinity chromatography. Enzymatic activity assays with catechol, 4-methyl catechol, pyrogallol, chlorogenic acid and caffeic acid substrates. The optimum reaction conditions were determined to be 0.1 M concentration for catecholic substrate, pH: 7.2 and temperature: 37°C; the pH dependence of the enzyme activity was quite pronounced in a range of 6 to 9 for the catechol reaction. Two other affinity gels were prepared for the use in affinity chromatography: Sepharose 4B-L-Tyrosine-p-aminobenzoic acid and Sepharose 6B-L-Tyrosine-p- aminobenzoic acid. Purification fold of147.73 and 154.00 was achieved on the respective gels. On both gel preparations kinetic comparisons with the purified PPO enzymes were carried out. The structural integrity and molecular weight of purified PPO enzymes were analyzed by Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS- PAGE) and Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Native-PAGE), respectively. SDS-PAGE showed PPO bands corresponding to 35-50 KDa (4B gel) and much more pronounced at 50 kDa, with faintly band at 35 kDa (6B gel). Native- PAGE, both bands isolated from the gels analyses were between 50-70 kDa and 100 kDa respectively. In this thesis, synthesis of Sepharose 6B-L-Tyrosine-p-aminobenzoic acid as an affinity gel is reported for the first time and the first successful purification of avocado PPO using it.
Benzer Tezler
- Farklı avokado (Persea americana Mill.) çeşitlerinden yağ eldesinde uygulanan ultrasound, ultraturrax ve mikrodalga ön işlemlerinin yağ verimi ve yağın özellikleri üzerine etkisi
The effect of ultrasonic, ultraturrax and microwave pretreatment applied to oils obtained from different avacado species on oil yield and oil features
SERDAR GÜZEL
Yüksek Lisans
Türkçe
2018
Gıda MühendisliğiErciyes ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. HASAN YALÇIN
- Hasat sonrası melatonin uygulamasının soğukta muhafaza süresince avokado meyvelerinin biyokimyasal içerikleri ve bazı kalite kriterleri üzerine etkisi
Effect of postharvest melatonin treatment on biochemical contents and some quality criteria of avocado fruits during cold storage
KÜBRA FEYZA YILMAZ
Yüksek Lisans
Türkçe
2024
ZiraatBolu Abant İzzet Baysal ÜniversitesiBahçe Bitkileri Ana Bilim Dalı
PROF. DR. MÜTTALİP GÜNDOĞDU
DR. ÖĞR. ÜYESİ AKGÜL TAŞ
- Bazı avokado (Persea americana Mill.) çeşitlerinin püre üretimine uygunluklarının belirlenmesi ve ürün stabilitesi üzerine depolama sıcaklığının etkisi
Determination of convenient some avocado (Persea american Mill.) cultivars for puree production and the effect of storage temperatures on the product stability
MUHARREM GÖLÜKCÜ
Doktora
Türkçe
2006
Gıda MühendisliğiAkdeniz ÜniversitesiGıda Mühendisliği Ana Bilim Dalı
PROF. DR. FERAMUZ ÖZDEMİR
- Ftir spektroskopisinin avokado (persea americana mill.) analizinde kullanımı
The Use of ftir spectroscopy in analysis of avocado
NUMAN HODA
- Ceratitis capitata Wied. (Diptera: Tephritidae)'nın Balcalı (Adana)'da farklı meyve bahçelerindeki populasyon dalgalanması ve laboratuvar koşullarında sıcaklığın gelişme süresine etkisi
Ceratitis capitata Wied. (Diptera: Tephritidae) of population fluctations different fruits orchards in Balcalı (Adana) and laboratuary condition affecting at the devolepment time
GÜLSEVİM TİRİNG